このプロトコルの全体的な目的は、フローサイトメトリーを介して二重蛍光細胞を測定することによってBK-ポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性を測定することである。BK-ポリオマウイルスは、免疫不全患者、特に腎移植レシピエントにおいて重篤な病態を引き起こす可能性がある。しかし、現在、高効率のウイルス対策が利用できないので、他の化合物の潜在的な抗ウイルス影響を測定する方法が必要です。
この方法により、ウイルス学者は、非コード制御領域によって駆動されるBK-ポリオマウイルス転写活性に影響を及ぼす潜在的な抗ウイルス剤の影響を分析することができる。このアッセイは、非コード制御領域の典型的な非コード化領域と比較してプロモーター活性に対する再調整の影響をさらに研究することを可能にする。二重蛍光報告を用いてウイルスプロモーター活性を研究する利点は、早期および後期の遺伝子発現を相互に独立した方法で分析できることである。
さらに、ウイルスストックや長期感染性細胞培養実験の難しい穿光は、トランスフェクトや蛍光細胞のみが解析されるため、また細胞の生存率や穿光を低下させる薬剤も検討できる。このプロトコルはデュースブルク・エッセン大学の医学部の倫理委員会によって承認された人間の研究のガイドラインに従います.最初のステップは、ポリオマウイルスDNAの単離のための血液サンプルを収集することです。
EDTA取得管に血液の少なくとも3ミリリットルを収集します。サンプルを2,500Gで15分間遠心し、プラズマを新しいチューブにピペットします。40マイクロリットルのプロテインSKを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに調製し、ピペット処理で400マイクロリットルのプラズマを加えます。
メーカーの説明に記載されているように、DNAブロット抽出キットを使用してDNAを分離します。プライマーペアAを使用して50マイクロリットルの総体積でプリPCR用のマスターミックスを準備し、以前に単離されたDNAを使用します。45マイクロリットルのマスターミックスをPCRチューブに分配します。
PCRチューブに5マイクロリットルの単離DNAを加え、表3に示すように反応条件でPCRを実行します。変性アニールと延長を35サイクルで繰り返します。ネストされたアプリケーションの場合は、プライマー ペア B を使用し、クローニング用の制限サイトを収容します。
PCR製品の10マイクロリットルを、6倍のゲルローディング染料の2マイクロリットルと混合します。1.5%のアガロースゲルに10マイクロリットルのミックスをロードし、60ミランペアで30分間ゲルを実行します。適切な UV ドキュメント システムを使用してゲルを視覚化します。
メーカーの指示に従って PCR 精製キットを使用して PCR アンプアイコンを精製します。37°Cで2時間の指標制限酵素で精製されたアンプリコンを消化します。消化されたアンプリコンを精製するために精製手順を繰り返します。
並行して、プラスミド骨格も消化する。0.8%低マウントアガロースゲルで消化プラスミド骨格を分析します。ゲルを40ミリアンペアより高い電流で動かないでください。
長波UV光を使用してDNA断片を可視化し、きれいなメスを使用して曲がった背骨を切り取ります。DNA損傷を防ぐため、紫外線の長時間の暴露を避けてください。新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管にフロメルゲル断片の部分のためのフェンス。
ゲル片を溶かし、穏やかな渦で2分ごとに混ぜるために、低モードアガロース片を含む背骨を摂氏65度で10分間加熱します。溶融ゲルは、直接ライゲーションに使用することができる。リゲート骨格と16°Cで一晩T4 DNAリガーゼを使用して消化アンプリコン。
標準的なクローニング手順の後、血漿DNAを分離する。制限酵素消化を行い、陽性クローンをチェックし、1%アガロースゲル上で消化断片を可視化します。種子100,000 HEK293T細胞は、トランスフェクションの24時間前に12ウェルプレートのウェルあたり、摂氏37度で一晩インキュベートし、トランスフェクション中に活性な増殖を維持する。
細胞はトランスフェクション時に約80%のコンフルエンシーである必要があります。250マイクロリットルの減らされた血清培地を無菌チューブに入れ、報告された各血漿DNAのマイクログラムを1マイクログラム加え、ピペットで穏やかに混ぜます。トランスフェクション試薬の3マイクロリットルをDNA混合物に加え、ピペット処理で穏やかに混ぜ、摂氏22度で15分間インキュベートします。
混合物を加え、井戸に落とし、井戸にそっと分配します。4時間後、上清を試験剤および溶媒制御を含む新鮮な培地に交換してください。本例では、mTOR阻害剤INK-128およびラパマイシンを用いた。
分析まで摂氏37度でインキュベートします。蛍光顕微鏡で細胞の蛍光と緑色を確認します。赤色および緑色蛍光は、BK-ポリオマウイルス遺伝子発現の初期および後期にそれぞれ対応する。
トランスフェクション後72時間、上清を慎重に熱望する。冷たいPBSの1ミリリットルで細胞を2回洗います。500マイクロリットルのトリプシンを軽く加え、細胞の早期剥離を避けるためにプレートを少し回します。
この手順は、セルのダブレットを避けるために重要です。添加後、トリプシンは同じピペットチップで直接除去される。37°Cで少なくとも5分間細胞をインキュベートする。
3%FCSを含む1ミリリットルPBSでトリプシンS細胞を再中断し、事前に標識されたFACSチューブに懸濁液を移す。FACS分析の前に1ミリリットルあたり1マイクログラムの濃度でDAPIを追加します。フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。
各サンプルについて、少なくとも10,000個の生細胞を測定する。正確な結果を得るためには、赤と緑の信号を区別するためには、初期補償が不可欠です。非コーディング制御リージェントは、クローニングのための制限部位を収容する内側プライマーペアを使用して、ネストされたPCRプロトコルを使用して増幅した。
アンプリコン検証はアガロースゲル電気泳動を介して行ったが、ゲル内の均質なサイズ分布における典型的なNCCR配列に由来するアンプリコンは、挿入および欠失を伴う再配置されたNCCCrに由来するもので、その大きさが異なる。NCCRを含む陽性クローンの選択は、制限分析によって検証された。小さなスペーサー領域を、陽性クローンを示すより大きなNCCR断片に置き換えた。
検証されたクローンから単離されたプラスミドDNAをピロシケンシングのために送った。この例では、Pブロック内の削除とOブロック内の置換が検出されました。HEK293T細胞は、一過性の報告可能な構築物に関する点でトランスフェクトされ、NCCR活性は蛍光顕微鏡でモニタリングした。
赤色蛍光と緑色蛍光は、BK-ポリオマウイルス遺伝子発現の初期および後期にそれぞれ対応した。最初のNCCRは強い後期遺伝子発現を示し、2番目の例は比較的強い初期のが、中程度の後期遺伝子発現を有していた。DAPI陰性細胞をゲートし、eGFP対tdTomatoを示すドットプロットを作成した。
tdTomatoまたはeGFPの場合にのみ陽性のサンプルと同様に陰性であったサンプルが分析に含まれていた。平均蛍光強度は、各試験クローンから導出された。この例では、二重mTOR阻害剤INK128による治療は、早期発現が阻害されたことを意味するtdTomato MFIを有意に低下させた。
この方法は、転写活性を通じてBK-ポリマウイルスを検出するために現在使用されている他の化合物を同定することを可能にする。初期の遺伝子発現では、これはウイルスの意味を決定する。阻害低下は、BK-ポリマウイルス再活性化の場合に免疫不全患者の薬剤として使用されると考えられる。
