L'obiettivo generale di questo protocollo è misurare l'attività trascrizionale guidata dalla regione di controllo non codificante BK-polyomavirus misurando due celle fluorescenti tramite citometria a flusso. Il BK-poliomavirus può causare gravi patologie nei pazienti immunocompro compromessi, specialmente nei riceventi di trapianti renali. Tuttavia, poiché attualmente non sono disponibili antivirus altamente efficaci, sono necessari metodi che misurino il potenziale impatto antivirali di altri composti.
Questo metodo consente ai virologi di analizzare l'impatto di potenziali agenti antivirali che influenzano l'attività trascrizionale del BK-poliomavirus guidata dalla regione di controllo non codificante. Questo saggio consente inoltre di studiare l'influenza dei riarrangiamenti sull'attività del promotore rispetto alle regioni archetipiche di controllo non codificanti. Il vantaggio di studiare l'attività del promotore virale con un rapporto di doppia fluorescenza è che l'espressione genica precoce e tardiva può essere analizzata in modo reciprocamente indipendente.
Inoltre, la difficile perforazione delle scorte virali e gli esperimenti di coltura cellulare infettiva a lungo termine non sono necessari poiché vengono analizzate solo le cellule trasfette e fluorescenti, è possibile studiare anche farmaci che riducono la vitalità cellulare e la perforazione. Questo protocollo segue le linee guida della ricerca umana approvate dal comitato etico della facoltà di medicina dell'Università di Duisburg-Essen. Il primo passo è raccogliere campioni di sangue per l'isolamento del DNA del poliomavirus.
Raccogliere almeno tre millilitri di sangue in tubi di acquisizione EDTA. Centrifugare il campione a 2.500 G per 15 minuti e pipettare il plasma in un nuovo tubo. Preparare 40 microlitri di proteina SK in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 400 microlitri plasma mediante pipettaggio.
Isolare il DNA utilizzando un kit di estrazione della macchia di DNA come descritto nelle istruzioni del produttore. Preparare il master mix per il pre-PCR utilizzando la coppia di primer A in un volume totale di 50 microlitri e utilizzare il DNA precedentemente isolato. Distribuire 45 microlitri del master mix nei tubi PCR.
Aggiungere cinque microlitri del DNA isolato nei tubi PCR ed eseguire il PCR con le condizioni di reazione illustrate nella tabella tre. Ripetere la ricottura e l'estensione della denaturazione in 35 cicli. Per l'applicazione nidificata, utilizzare la coppia di primer B, che ospita i siti di restrizione per la clonazione.
Mescolare 10 microlitri del prodotto PCR con due microlitri di colorante a caricamento in gel a sei pieghe. Caricare 10 microlitri della miscela su un gel di agarosio all'1,5% ed eseguire il gel per 30 minuti a 60 milliampere. Visualizzare il gel utilizzando un adeguato sistema di documentazione UV.
Purificare gli ampliconi PCR utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Digerire le ampliconi purificate con gli enzimi di restrizione degli indicatori per due ore a 37 gradi Celsius. Ripetere i passaggi di purificazione per purificare le ampliconi digerite.
In parallelo, digerire anche la spina dorsale plasmide. Analizzare la spina dorsale plasmide digerita su un gel di agarosio a basso montaggio dello 0,8%. Non eseguire il gel a una corrente superiore a 40 milliampere.
Visualizza i frammenti di DNA usando la luce UV ad onde lunghe e ritaglia la spina dorsale piegata usando un bisturi pulito. Evitare lunghi tempi di esposizione ai raggi UV per prevenire danni al DNA. Recinzione per il pezzo di frammento di gel di flomel in un nuovo tubo di micro-centrifuga da 1,5 millilitri.
Riscaldare la spina dorsale contenente pezzo di agarosio in modalità bassa per 10 minuti a 65 gradi Celsius per sciogliere il pezzo di gel e mescolare ogni due minuti con un vortice delicato. Il gel fuso può essere utilizzato direttamente per la legatura. Spina dorsale ligata e amplicone digerito usando la ligasi del DNA T4 durante la notte a 16 gradi Celsius.
Dopo la procedura di clonazione standard, isolare il DNA plasmatico. Eseguire la digestione enzimatica di restrizione per verificare la presenza di cloni positivi e visualizzare frammenti digeriti su un gel di agarosio all'1%. Le cellule di semi 100.000 HEK293T per pozzo della piastra di 12 pozzi 24 ore prima della trasfezione e dell'incubazione durante la notte a 37 gradi Celsius, mantengono la proliferazione attiva durante la trasfezione.
Le cellule devono essere approssimativamente all'80% di confluenza alla trasfezione. Posizionare 250 microlitri di mezzi sieri ridotti in un tubo sterile e aggiungere un microgrammo di ogni DNA plasmatico riportato e mescolare delicatamente mediante pipettazione. Aggiungere tre microlitri del reagente di trasfezione alla miscela di DNA e mescolare delicatamente pipettando e incubando per 15 minuti a 22 gradi Celsius.
Aggiungere la miscela, a goccia al pozzo e distribuire delicatamente al pozzo. Dopo quattro ore, sostituire il supernatante con un mezzo fresco contenente gli agenti di prova e il controllo del solvente. In questo esempio sono stati utilizzati gli inibitori mTOR INK-128 e rapamicina.
Incubare a 37 gradi Celsius fino all'analisi. Controllare la presenza di fluorescenza rossa e verde al microscopio a fluorescenza. La fluorescenza rossa e verde corrispondono rispettivamente all'espressione genica BK-polyomavirus precoce e tardiva.
72 ore dopo la trasfezione, aspirare con cura al supernatante. Lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS freddo. Aggiungere delicatamente 500 microlitri tripina e ruotare leggermente la piastra per evitare il distacco prematuro delle cellule.
Questo passaggio è importante per evitare doppietti cellulari. Dopo l'aggiunta, la tripsiderina viene rimossa direttamente con la stessa punta della pipetta. Incubare le cellule per almeno cinque minuti a 37 gradi Celsius.
Sospendere di nuovo le celle di trypsina S con un PBS millilitro contenente il 3%FCS e trasferire la sospensione in tubi FACS preetichettati. Aggiungere DAPI a una concentrazione di un microgrammo per millilitro prima dell'analisi FACS. Analizzare le celle utilizzando un citometro a flusso.
Per ogni campione, misurare almeno 10.000 cellule viventi. La compensazione iniziale è essenziale per distinguere i segnali rossi e verdi per ottenere risultati accurati. Il reggente di controllo non codificante è stato amplificato utilizzando un protocollo PCR annidato utilizzando la coppia di primer interni che ospita i siti di restrizione per la clonazione.
La verifica dell'amplicone è stata eseguita tramite elettroforesi del gel di agarosio Mentre gli ampliconi derivati da sequenze NCCR archetipiche ad una distribuzione omogenea delle dimensioni nel gel, quelle derivate da NCCR riarrangiati con inserimenti ed eliminazioni, differivano per le loro dimensioni. La selezione dei cloni positivi contenenti l'NCCR è stata verificata mediante analisi delle restrizioni. La piccola regione distanziale è stata sostituita dai frammenti NCCR più grandi che indicano cloni positivi.
Il DNA plasmide isolato dai cloni verificati è stato inviato per il pirosioquenziamento. In questo esempio sono state rilevate l'eliminazione nel blocco P e la sostituzione in blocco O. Le cellule HEK293T sono state trasfette transitoriamente nel rispetto del costrutto segnalabile e l'attività NCCR è stata monitorata da una microscopia a fluorescenza.
Le fluorescenti rosse e verdi corrispondevano rispettivamente all'espressione genica BK-polyomavirus precoce e tardiva. Il primo NCCR mostrava una forte espressione genica tardiva mentre il secondo esempio aveva un'espressione genica precoce ma moderata relativamente forte. Le celle negative DAPI sono state gated ed è stato creato un grafico a punti che mostra eGFP rispetto a tdTomato.
Nell'analisi sono stati inclusi solo campioni negativi e positivi solo per tdTomato o eGFP. Le intensità media di fluorescenza sono state derivate da ogni clone di prova. In questo esempio, il trattamento con l'inibitore del doppio mTOR INK128 ha ridotto significativamente tdTomato MFI, il che significa che l'espressione precoce è stata inibita.
Questo metodo consente di identificare i composti attualmente utilizzati e altri composti per rilevare il BK-poliomavirus attraverso l'attività trascrizionale. Nella prima espressione genica, questo determina decisamente l'implicazione virale. Le gocce inibitorie possono essere considerate come agenti per i pazienti immunocomprotiti nel caso della riattivazione del BK-poliomavirus.
