Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die nicht kodierierte Transkriptionsaktivität des BK-Polyomavirus zu messen, indem duale Fluoreszenzzellen mittels Durchflusszytometrie gemessen werden. Das BK-Polyomavirus kann schwere Pathologien bei immungeschwächten Patienten verursachen, insbesondere bei Nierentransplantationsempfängern. Da jedoch derzeit keine hochwirksamen Antivirenprogramme verfügbar sind, sind Methoden erforderlich, die die potenziellen antiviralen Auswirkungen anderer Verbindungen messen.
Diese Methode ermöglicht es Virologen, die Auswirkungen potenzieller antiviraler Wirkstoffe zu analysieren, die die Transkriptionsaktivität des BK-Polyomavirus beeinflussen, die von der nicht-kodierenden Kontrollregion angetrieben wird. Dieser Test ermöglicht es ferner, den Einfluss von Umlagerungen auf die Promotoraktivität im Vergleich zu archetypischen nicht kodierenden Kontrollregionen zu untersuchen. Der Vorteil der Untersuchung der viralen Promotoraktivität mit einem dualen Fluoreszenzbericht besteht darin, dass die frühe und späte Genexpression auf gegenseitig unabhängige Weise analysiert werden kann.
Darüber hinaus sind die schwierige Perforation von Virusbeständen und langfristige infektiöse Zellkulturexperimente nicht notwendig, da nur transfizierte und fluoreszierende Zellen analysiert werden, auch Medikamente zur Verringerung der Zelllebensfähigkeit und Perforation untersucht werden können. Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Humanforschung, die vom Ethikausschuss der medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen gebilligt wurden. Der erste Schritt besteht darin, Blutproben für die Isolierung der Polyomavirus-DNA zu sammeln.
Sammeln Sie mindestens drei Milliliter Blut in EDTA-Erfassungsröhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 2, 500 G für 15 Minuten und pipette das Plasma in ein neues Rohr. 40 Mikroliter Protein SK in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr vorbereiten und 400 Mikroliter Plasma durch Pipetieren hinzufügen.
Isolieren Sie die DNA mit einem DNA-Blot-Extraktionskit, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben. Bereiten Sie den Master-Mix für die Pre-PCR mit Primer-Paar A in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern vor und verwenden Sie die zuvor isolierte DNA. Verteilen Sie 45 Mikroliter des Master-Mix in die PCR-Röhren.
Fügen Sie fünf Mikroliter der isolierten DNA in die PCR-Röhren und führen Sie die PCR mit den Reaktionsbedingungen, wie in Tabelle 3 dargestellt. Wiederholen Denaturierung Glühen und Verlängerung in 35 Zyklen. Verwenden Sie für die geschachtelte Anwendung das Primerpaar B, das die Einschränkungssites für das Klonen birgt.
Mischen Sie 10 Mikroliter des PCR-Produkts mit zwei Mikrolitern sechsfachen Gel-Ladefarbstoffen. 10 Mikroliter der Mischung auf ein 1,5%Agarose-Gel laden und das Gel 30 Minuten bei 60 Milliampere laufen lassen. Visualisieren Sie das Gel mit einem geeigneten UV-Dokumentationssystem.
Reinigen Sie die PCR-Amplicons mit einem PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verdauen Sie die gereinigten Amplicons mit den Indikator-Restriktionsenzymen für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Wiederholen Sie die Reinigungsschritte, um die verdauten Amplicons zu reinigen.
Parallel dazu auch das Plasmid-Rückgrat verdauen. Analysieren Sie das verdaute Plasmid-Rückgrat auf einem 0,8%niedrigen Agarose-Gel. Führen Sie das Gel nicht mit einem höheren Strom als 40 Milliampere.
Visualisieren Sie DNA-Fragmente mit langwelligem UV-Licht und schneiden Sie das mit einem sauberen Skalpell gebogene Rückgrat aus. Vermeiden Sie lange UV-Belichtungszeiten, um DNA-Schäden zu verhindern. Zaun für das Stück Flomelgelfragment in ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr.
Erhitzen Sie das Rückgrat mit Low-Mode-Agarose-Stück für 10 Minuten bei 65 Grad Celsius, um das Gelstück zu schmelzen und alle zwei Minuten durch sanftes Wirbeln mischen. Das geschmolzene Gel kann direkt zur Ligation verwendet werden. Ligate Backbone und das verdaute Amplikon mit T4 DNA Ligase über Nacht bei 16 Grad Celsius.
Nach dem Standard-Klonverfahren die Plasma-DNA isolieren. Führen Sie die Restriktionsenzymverdauung durch, um nach positiven Klonen zu suchen und verdaute Fragmente auf einem 1%Agarose-Gel zu visualisieren. Samen 100, 000 HEK293T-Zellen pro Bohrgut der 12 Brunnenplatte 24 Stunden vor der Transfektion und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius, halten aktive Proliferation während der Transfetion.
Die Zellen sollten bei transftionierter Transfektion etwa 80 % Konfluenz aufweisen. Legen Sie 250 Mikroliter reduzierter Serummedien in sterile Röhre und fügen Sie ein Mikrogramm jeder gemeldeten Plasma-DNA hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Fügen Sie drei Mikroliter des Transfektionsreagenzins in die DNA-Mischung ein und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren und inkubieren Sie 15 Minuten bei 22 Grad Celsius.
Fügen Sie die Mischung, tropfenweise auf den Brunnen und sanft auf den Brunnen verteilen. Ersetzen Sie nach vier Stunden den Überstand durch ein frisches Medium, das die Prüfmittel und die Lösungsmittelkontrolle enthält. In diesem Beispiel wurden die mTOR-Inhibitoren INK-128 und Rapamycin verwendet.
Inkubieren Bei 37 Grad Celsius bis zur Analyse. Überprüfen Sie Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop auf rote und grüne Fluoreszenz. Rote und grüne Fluoreszenz entsprechen der frühen bzw. späten BK-Polyomavirus-Genexpression.
72 Stunden nach der Transfektion, vorsichtig den Überstand anstreben. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter kalten PBS. Fügen Sie vorsichtig 500 Mikroliter Trypsin hinzu und drehen Sie die Platte leicht, um eine vorzeitige Ablösung der Zellen zu vermeiden.
Dieser Schritt ist wichtig, um Zelldoublets zu vermeiden. Nach dem Zusatz wird Trypsin direkt mit der gleichen Pipettenspitze entfernt. Inkubieren Sie die Zellen für mindestens fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.
Trypsin-S-Zellen mit einem Milliliter PBS, die 3%FCS enthalten, wieder aufhängen und die Suspension in vorbeschriftete FACS-Röhren übertragen. Fügen Sie DAPI mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter vor der FACS-Analyse hinzu. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.
Messen Sie für jede Probe mindestens 10 000 lebende Zellen. Eine anfängliche Kompensation ist unerlässlich, um rote und grüne Signale zu unterscheiden, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Der nicht-kodierende Regelregent wurde mit einem verschachtelten PCR-Protokoll mit dem inneren Primer-Paar verstärkt, das die Beschränkungsstellen für das Klonen beherbergt.
Die Amplicon-Verifizierung wurde über Agarose-Gel-Elektrophorese durchgeführt, während die amplicons, die aus archetypischen NCCR-Sequenzen bei einer homogenen Größenverteilung im Gel abgeleitet wurden, die aus neu angeordneten NCCRs mit Einfügungen und Deletionen abgeleitet wurden, unterschieden sich in ihrer Größe. Die Auswahl positiver Klone, die die NCCR enthalten, wurde durch Eine Restriktionsanalyse überprüft. Der kleine Abstandsbereich wurde durch die größeren NCCR-Fragmente ersetzt, die positive Klone anzeigen.
Plasmid-DNA, die aus verifizierten Klonen isoliert wurde, wurde zur Pyrosequencing geschickt. In diesem Beispiel wurden das Löschen im P-Block und die Ersetzung im O-Block erkannt. HEK293T-Zellen wurden vorübergehend unter Berücksichtigung des meldepflichtigen Konstrukts transfiziert und die NCCR-Aktivität wurde durch eine Fluoreszenzmikroskopie überwacht.
Rote und grüne Fluoreszenzen entsprachen der frühen bzw. späten BK-Polyomavirus-Genexpression. Die erste NCCR zeigte eine starke späte Genexpression, während das zweite Beispiel eine vergleichsweise starke frühe, aber moderate späte Genexpression aufwies. DAPI-Negativzellen wurden abgezäutt und ein Punktdiagramm erstellt, das eGFP versus tdTomato zeigt.
Proben, die negativ waren, sowie solche, die nur für tdTomato oder eGFP positiv waren, wurden in die Analyse einbezogen. Aus jedem Testklon wurden mittlere Fluoreszenzintensitäten abgeleitet. In diesem Beispiel reduzierte die Behandlung mit dem Dual-mTOR-Hemmer INK128 tdTomato MFI signifikant, was bedeutet, dass die frühe Expression gehemmt wurde.
Diese Methode ermöglicht es, derzeit verwendete und andere Verbindungen zu identifizieren, um das BK-Polyomavirus durch Transkriptionsaktivität zu erkennen. Bei der frühen Genexpression bestimmt dies entschieden die virale Implikation. Hemmende Tropfen können als Wirkstoffe für immungeschwächte Patienten im Falle der BK-Polyomavirus-Reaktivierung verwendet werden.
