L’objectif global de ce protocole est de mesurer l’activité transcriptionnelle de la région de contrôle non codant du BK-polyomavirus en mesurant les cellules fluorescentes doubles par cytométrie de flux. Le BK-polyomavirus peut causer des pathologies graves chez les patients immunocompromisés, en particulier chez les receveurs de greffe rénale. Cependant, étant donné que les antivirus très efficaces ne sont actuellement pas disponibles, des méthodes mesurant l’impact antiviraux potentiel d’autres composés sont nécessaires.
Cette méthode permet aux virologues d’analyser l’impact des agents antiviraux potentiels affectant l’activité transcriptionnelle du BK-polyomavirus entraînée par la région de contrôle non codant. Cet essai permet en outre d’étudier l’influence des réarrangements sur l’activité du promoteur par rapport aux régions de contrôle non codantes archétypiques. L’avantage d’étudier l’activité virale de promoteur avec un rapport de fluorescence double est que l’expression tôt et tardive de gène peut être analysée d’une manière mutuellement indépendante.
En outre, la perforation difficile des stocks de virus et les expériences de culture cellulaire infectieuse à long terme ne sont pas nécessaires puisque seules les cellules transfected et fluorescentes sont analysées, également des médicaments réduisant la viabilité cellulaire et la perforation peuvent être étudiés. Ce protocole suit les lignes directrices de la recherche humaine approuvées par le comité éthique de la faculté de médecine de l’Université de Duisburg-Essen. La première étape consiste à prélever des échantillons de sang pour l’isolement de l’ADN du polyomavirus.
Recueillir au moins trois millilitres de sang dans des tubes d’acquisition EDTA. Centrifuger l’échantillon à 2500 G pendant 15 minutes et pipette le plasma dans un nouveau tube. Préparer 40 microlitres de protéines SK dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et ajouter 400 microlitres de plasma par pipetting.
Isoler l’ADN à l’aide d’une trousse d’extraction de taches d’ADN décrite dans les instructions du fabricant. Préparez le mélange principal pour le pré-PCR à l’aide de la paire d’amorce A dans un volume total de 50 microlitres et utilisez l’ADN précédemment isolé. Distribuer 45 microlitres du mélange principal dans les tubes PCR.
Ajouter cinq microlitres de l’ADN isolé dans les tubes PCR et exécuter le PCR avec les conditions de réaction comme illustré dans le tableau trois. Répétez l’annealage et l’extension de dénaturation en 35 cycles. Pour l’application imbriquée, utilisez la paire d’amorce B, hébergeant les sites de restriction pour le clonage.
Mélangez 10 microlitres du produit PCR avec deux microlitres de teinture de chargement de gel six fois. Chargez 10 microlitres du mélange sur un gel agarose de 1,5 % et exécutez le gel pendant 30 minutes à 60 milliampères. Visualisez le gel à l’aide d’un système de documentation UV approprié.
Purifiez les amplicons PCR à l’aide d’un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Digérer les amplicons purifiés avec les enzymes de restriction indicateur pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Répétez les étapes de purification pour purifier les amplicons digérés.
En parallèle, digérer également l’épine dorsale plasmide. Analyser l’épine dorsale plasmide digérée sur un gel d’agarose à faible teneur en monture de 0,8 %. Ne pas faire fonctionner le gel à un courant plus élevé que 40 milliampères.
Visualisez les fragments d’ADN à l’aide de la lumière UV à ondes longues et découpez l’épine dorsale pliée à l’aide d’un scalpel propre. Évitez les longs temps d’exposition aux UV pour prévenir les dommages causés par l’ADN. Clôture pour le morceau de fragment de gel flomel dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Chauffer l’épine dorsale contenant un morceau d’agarose à faible mode pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius afin de faire fondre le morceau de gel et mélanger toutes les deux minutes par vortex doux. Le gel fondu peut être directement utilisé pour la ligature. Ligate épine dorsale et l’amplicon digéré en utilisant ligase D’ADN T4 nuit à 16 degrés Celsius.
Après la procédure standard de clonage, isoler l’ADN plasmatique. Effectuer la digestion des enzymes de restriction pour vérifier les clones positifs et visualiser les fragments digérés sur un gel de 1% agarose. Graine 100 000 cellules HEK293T par puits de la plaque de puits 24 heures avant la transfection et l’incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius, maintenir la prolifération active pendant la transfection.
Les cellules doivent être approximativement à 80% confluency à la transfection. Placer 250 microlitres de sérum réduit dans le tube stérile et ajouter un microgramme de chaque ADN plasmatique rapporté et mélanger délicatement par pipetting. Ajouter trois microlitres du réaccente de transfection au mélange d’ADN et mélanger délicatement par pipetting et incuber pendant 15 minutes à 22 degrés Celsius.
Ajouter le mélange, laisser tomber au puits et distribuer délicatement au puits. Après quatre heures, remplacer le supernatant par un milieu frais contenant les agents d’essai et le contrôle des solvants. Dans cet exemple, les inhibiteurs du mTOR INK-128 et de la rapamycine ont été utilisés.
Incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Vérifiez la fluorescence rouge et verte des cellules au microscope à fluorescence. La fluorescence rouge et verte correspond à l’expression précoce et tardive du gène BK-polyomavirus respectivement.
72 heures après la transfection, aspirez soigneusement au surnatant. Lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS froid. Ajouter délicatement 500 microlitres trypsine et tourner légèrement la plaque pour éviter le décollement prématuré des cellules.
Cette étape est importante pour éviter les doublets cellulaires. Après addition, la trypsine est enlevée directement avec la même pointe de pipette. Incuber les cellules pendant au moins cinq minutes à 37 degrés Celsius.
Suspendre à nouveau les cellules trypsine S avec un millilitre de PBS contenant 3 % de FCS et transférer la suspension dans des tubes FACS pré-étiquetés. Ajouter dapi à une concentration d’un microgramme par millilitre avant l’analyse FACS. Analyser les cellules à l’aide d’un cytomètre d’écoulement.
Pour chaque échantillon, mesurez au moins 10 000 cellules vivantes. La compensation initiale est essentielle pour distinguer les signaux rouges et verts pour obtenir des résultats précis. Le régent de contrôle non codant a été amplifié à l’aide d’un protocole PCR imbriqué à l’aide de la paire d’amorce intérieure qui abrite les sites de restriction pour le clonage.
La vérification amplicon a été effectuée par électrophoresis de gel d’agarose tandis que les amplicons dérivés des séquences archétypiques de NCCR à une distribution homogène de taille dans le gel, ceux dérivés des RCNC réarrangés avec des insertions et des suppressions, différaient dans leur taille. La sélection de clones positifs contenant le NCCR a été vérifiée par analyse de restriction. La petite région de l’espaceur a été remplacée par les plus gros fragments du NCCR indiquant des clones positifs.
L’ADN plasmide isolé des clones vérifiés a été envoyé pour le pyrosequencing. Dans cet exemple, la suppression dans le bloc P et la substitution dans le bloc O ont été détectées. Les cellules HEK293T ont été transitoirement transfectées dans le respect de la construction à déclarer et l’activité de NCCR a été surveillée par une microscopie de fluorescence.
Les fluorescents rouges et verts correspondaient respectivement à l’expression précoce et tardive du gène BK-polyomavirus. Le premier NCCR a montré une forte expression tardive de gène tandis que le deuxième exemple a eu une expression tôt mais modérée de gène tôt comparativement forte. Les cellules négatives de DAPI ont été gated et une parcelle de point a été créée montrant eGFP contre tdTomato.
Les échantillons qui étaient négatifs ainsi que ceux positifs pour tdTomato ou eGFP seulement ont été inclus dans l’analyse. Des intensités de fluorescence moyenne ont été dérivées de chaque clone d’essai. Dans cet exemple, le traitement avec l’inhibiteur double de mTOR INK128 a sensiblement réduit tdTomato MFI qui signifie que l’expression tôt a été inhibée.
Cette méthode permet d’identifier les composés actuellement utilisés et d’autres pour détecter le BK-polyomavirus par l’activité transcriptionnelle. Dans l’expression précoce des gènes, cela détermine décidément l’implication virale. Des gouttes inhibitrices pourraient être considérées comme agents pour les patients immunocompromised dans le cas de la réactivation de BK-polyomavirus.
