El objetivo general de este protocolo es medir la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificantes BK-polyomavirus midiendo las células fluorescentes duales a través de la citometría de flujo. El BK-poliomavirus puede causar patologías graves en pacientes inmunocomprometidos, especialmente en los receptores de trasplante renal. Sin embargo, dado que los antivirus altamente eficaces actualmente no están disponibles, se requieren métodos que miden el impacto potencial antiviral de otros compuestos.
Este método permite a los virólogos analizar el impacto de los posibles agentes antivirales que afectan a la actividad transcripcional BK-polyomavirus impulsada por la región de control no codificante. Este ensayo permite estudiar aún más la influencia de los reordenamientos en la actividad del promotor en comparación con las regiones de control arquetípicas no codificantes. La ventaja de estudiar la actividad promotora viral con un informe de fluorescencia dual es que la expresión génica temprana y tardía puede ser analizada de manera mutuamente independiente.
Además, la difícil perforación de las poblaciones de virus y los experimentos de cultivo celular infeccioso a largo plazo no son necesarios, ya que sólo se analizan las células trans infectadas y fluorescentes, también se pueden estudiar fármacos que reducen la viabilidad celular y la perforación. Este protocolo sigue las directrices de la investigación humana aprobadas por el comité ético de la facultad de medicina de la Universidad de Duisburg-Essen. El primer paso es recoger muestras de sangre para el aislamiento del ADN del poliomavirus.
Recoger al menos tres mililitros de sangre en tubos de adquisición de EDTA. Centrifugar la muestra a 2.500 G durante 15 minutos y pipetear el plasma en un tubo nuevo. Preparar 40 microlitros de proteína SK en un tubo de micro-centrífuga de 1,5 mililitros y añadir 400 microlitros de plasma por pipeteo.
Aísle el ADN utilizando un kit de extracción de manchas de ADN como se describe en las instrucciones del fabricante. Prepare la mezcla maestra para el pre-PCR utilizando el par de imprimación A en un volumen total de 50 microlitros y utilice el ADN previamente aislado. Distribuya 45 microlitros de la mezcla maestra en los tubos PCR.
Agregue cinco microlitros del ADN aislado a los tubos de PCR y ejecute la PCR con las condiciones de reacción como se ilustra en la tabla tres. Repita el recocido y la extensión de la desnaturalización en 35 ciclos. Para la aplicación anidada, utilice el par de imprimación B, que alberga los sitios de restricción para la clonación.
Mezclar 10 microlitros del producto PCR con dos microlitros de seis veces de colorante de carga de gel. Cargue 10 microlitros de la mezcla en un gel de 1,5% de agarosa y ejecute el gel durante 30 minutos a 60 miliamperios. Visualice el gel utilizando un sistema de documentación UV adecuado.
Purifique el amplicons PCR utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Digerir el amplicons purificado con las enzimas de restricción del indicador durante dos horas a 37 grados centígrados. Repita los pasos de purificación para purificar los amplicons digeridos.
Paralelamente, también digerir la columna vertebral del plásmido. Analizar la columna vertebral del plásmido digerido en un gel de agarosa de montaje bajo al 0,8%. No ejecute el gel a una corriente superior a 40 miliamperios.
Visualice fragmentos de ADN usando luz UV de onda larga y corte la columna vertebral doblada usando un bisturí limpio. Evite tiempos de exposición UV largos para prevenir daños en el ADN. Cerca para la pieza de fragmento de gel de flomel en un nuevo tubo de micro-centrífuga de 1,5 mililitros.
Calienta la columna vertebral que contiene la pieza de agarosa de modo bajo durante 10 minutos a 65 grados Celsius para derretir la pieza de gel y mezclar cada dos minutos mediante un vórtice suave. El gel fundido se puede utilizar directamente para la ligadura. Espina dorsal ligada y el amplicon digerido usando ligasa de ADN T4 durante la noche a 16 grados centígrados.
Después del procedimiento de clonación estándar, aísle el ADN plasmático. Realizar la digestión enzimática de restricción para comprobar si hay clones positivos y visualizar fragmentos digeridos en un gel de 1% de agarosa. Semilla 100,000 células HEK293T por pozo de la placa de 12 pozos 24 horas antes de la transfección e incubar durante la noche a 37 grados Celsius, mantener la proliferación activa durante la transfección.
Las células deben estar aproximadamente al 80% de confluencia en la transfección. Coloque 250 microlitros de medios séricos reducidos en tubo estéril y agregue un microgramo de cada ADN plasmático reportado y mezcle suavemente por pipeteo. Añadir tres microlitros del reactivo de transfección a la mezcla de ADN y mezclar suavemente por pipeteo e incubar durante 15 minutos a 22 grados Centígrados.
Agregue la mezcla, deje caer al pozo y distribuya suavemente al pozo. Después de cuatro horas, sustituya el sobrenadante por un medio fresco que contenga los agentes de prueba y el control de disolventes. En este ejemplo, se utilizaron los inhibidores mTOR INK-128 y rapamicina.
Incubar a 37 grados centígrados hasta el análisis. Compruebe si las células tienen fluorescencia roja y verde bajo el microscopio de fluorescencia. La fluorescencia roja y verde corresponde a la expresión génica BK-poliomavirus temprana y tardía, respectivamente.
72 horas después de la transfección, aspirar cuidadosamente al sobrenadante. Lave las células dos veces con un mililitro de PBS frío. Agregue suavemente 500 microlitros de trippsina y gire la placa ligeramente para evitar el desprendimiento prematuro de las células.
Este paso es importante para evitar los dobletes de celda. Después de la adición, la trippsina se elimina directamente con la misma punta de pipeta. Incubar las células durante al menos cinco minutos a 37 grados centígrados.
Re-suspenda las células de tripsina S con un mililitro PBS que contiene 3%FCS y transfiera la suspensión en tubos FACS preetiquetados. Añadir DAPI a una concentración de un microgramo por mililitro antes del análisis de FACS. Analice las células utilizando un citometro de flujo.
Para cada muestra, mida al menos 10.000 células vivas. La compensación inicial es esencial para distinguir las señales rojas y verdes para lograr resultados precisos. El regente de control no codificante se amplió utilizando un protocolo PCR anidado utilizando el par de imprimación interna que alberga los sitios de restricción para la clonación.
La verificación del amplicon se realizó a través de la electroforesis de gel de agarosa Mientras que los amplicons derivados de secuencias arquetípicas NCCR en una distribución de tamaño homogéneo en el gel, los derivados de los NCCR reorganizados con inserciones y eliminaciones, diferían en su tamaño. La selección de clones positivos que contienen el NCCR se verificó mediante un análisis de restricciones. La pequeña región espaciadora fue reemplazada por los fragmentos NCCR más grandes que indican clones positivos.
El ADN plásmido aislado de clones verificados fue enviado para la pirosecuenciación. En este ejemplo, se detectaron la eliminación en el bloque P y la sustitución en el bloque O. Las células HEK293T fueron transfectadas transitoriamente con el respeto de la construcción reportable y la actividad del NCCR fue monitoreada por una microscopía de fluorescencia.
Los fluorescentes rojos y verdes correspondían a la expresión génica BK-poliomavirus temprana y tardía respectivamente. El primer NCCR mostró una fuerte expresión génica tardía, mientras que el segundo ejemplo tuvo una expresión génica tardía relativamente fuerte, pero moderada. Las celdas negativas DAPI fueron cerradas y se creó una gráfica de puntos que muestra eGFP versus tdTomato.
Las muestras que fueron negativas, así como las positivas para tdTomato o eGFP sólo se incluyeron en el análisis. Las intensidades medias de fluorescencia se derivaron de cada clon de prueba. En este ejemplo, el tratamiento con el inhibidor de mTOR dual INK128 redujo significativamente la IMF tdTomato, lo que significa que se inhibió la expresión temprana.
Este método permite identificar los compuestos utilizados actualmente y otros compuestos para detectar el BK-poliomavirus a través de la actividad transcripcional. En la expresión génica temprana, esto determina decididamente la implicación viral. Las gotas inhibidoras pueden considerarse utilizadas como agentes para los pacientes inmunocomprometidos en el caso de reactivación del BK-poliomavirus.
