لذلك يسمح لنا بروتوكولنا بإعداد الأحماض الدهنية الإيبوكسي ، وقد تساعد هذه الطريقة في تقدم الأبحاث على الآليات التي تعمل بها هذه الأيضات في الجسم. تاريخيا، الأحماض الدهنية الايبوكسي نقية من الصعب جدا الحصول عليها. لذلك بروتوكول لدينا هو بسيط وسريع وفعال من حيث التكلفة، وأنه يسمح لنا لإعداد كميات كبيرة من هذه الأيض.
نعم، قمنا بتطوير بروتوكول لإدارة الشؤون الإنسانية، لكنه يعمل أيضا بشكل جيد جدا لوكالة حماية البيئة وحمض arachidonic. العمل بسرعة، وبعض الكواشف حساسة للهواء، وبالتحديد DHA و NADPH، وتأكد من إقران كل شيء مقدما بحيث يكون الإعداد بسيطًا. أيضا، أن تكون على بينة من المخاطر.
يستخدم بروتوكولنا تقنيات في كل من علم الأنزيم والكيمياء العضوية. يعد التصور أمرًا بالغ الأهمية لمساعدة القراء والمشاهدين الذين لا يعرفون التقنيات المتخصصة في هذه المجالات. للتطعيم، استخدم حلقة معقمة أو ماصة مغموسة في مخزون الجلسرين من pBS-BM3 transfected DH5-ألفا E.coli إلى خمسة ملليلتر من مرق LB العقيمة المكملة مع 0.5 ملليغرام من الأمبيسيلين.
احتضان ثقافة الخلية في شاكر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في 200 دورة في الدقيقة. ثم، إضافة ثقافة بداية خمسة ملليلتر و 100 ملليغرام من الأمبيسيلين إلى لتر واحد من مرق LB العقيمة في قارورة Erlenmeyer. يهز في 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات في 200 دورة في الدقيقة، ثم في 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في 200 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك، وجمع ثقافة الخلية في أنابيب الطرد المركزي، والطرد المركزي ثقافة الخلية في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقيقة في 1،000 مرات ز. صب قبالة زانة في قارورة أخرى. تطهير مع التبييض أو باستخدام الأوتوكلاف، وتخزين بيليه الخلية في ناقص 78 درجة مئوية حتى تنقية انزيم.
لأداء تحلل الخلية، أولا ذوبان بيليه الخلية على الجليد، و resuspend في 40 ملليلتر من الجليد الباردة solubilization العازلة التي تحتوي على تريس، PMSF، وEDTA. بينما على الجليد، sonicate الخلايا لمدة دقيقة واحدة مع التجانس بالموجات فوق الصوتية، مع إعداد قوة الانتاج من 10 وواجب من 100، تليها استراحة دقيقة واحدة على الجليد من أجل تسييز الخلايا. كرر هذا الإجراء ست مرات.
الطرد المركزي الخلية lysate في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في 11،000 مرات ز إلى بيليه حطام الخلية. لأداء اللوني تقارب، في غرفة باردة أو ثلاجة مع باب منزلق، في أربع درجات مئوية، أولا إعداد عمود اللونية تبادل أنيون قوية عن طريق غسل الراتنج مع وحدات التخزين خمسة أعمدة من العازلة A من تريس 10 ملليمولار في درجة الحرارة 7.8. بعد ذلك ، إضافة عظمى من الخلية lysates إلى العمود التوازنية ، وغسل العمود مع ثلاثة مجلدات العمود من المخزن البارد A.Then ، elute BM3 عن طريق غسل العمود مع ستة مجلدات العمود من المخزن البارد B من تريس 10 ملليمولار وكلوريد الصوديوم 600 ملليمولار.
جمع الكسر المحمر البني eluent. إذا لم يتم استخدام البروتين على الفور، اخلطه مع حجم متساو من الجلسرين، وفلاش تجميد مع النيتروجين السائل. تخزين الحل المجمدة في ناقص 78 درجة مئوية.
لأداء إبوكسيد من إدارة الشؤون الإنسانية، أولا تحديد تركيز إنزيم BM3 المذاب، وفقا لطريقة تحليل ثنائي أكسيد الكربون الطيفي. ثم، في منقار يحتوي على لترين من العازلة رد فعل يجري تحريكها على لوحة ضجة المغناطيسي، إضافة 0.94 millimoles من DHA المخفف في 18.8 ملليلتر من DMSO وإنزيم BM3 المخفف إلى 20 نانومولر. في حين أن الحل هو اثارة، تبدأ رد فعل إبوكسيديشن بإضافة 8.7 ملليلتر من العازلة التفاعل التي تحتوي على 0.94 ملليمول من NADPH.
يحرك رد الفعل لمدة 30 دقيقة في حين محتدما الهواء في خليط التفاعل مع بالون مملوءة بالهواء تعلق على حقنة وإبرة مسجلة على داخل منقار. بعد ذلك ، قم برسم ميكرولتر واحد من خليط التفاعل ، ووضعها في مقياس طيف NanoDrop لقياس الامتصاص عند 340 نانومتر. استخدام الماء كفراغ.
إذا لم يكن هناك امتصاص المتبقية، مما يدل على أن NADPH قد استهلكت، رد فعل كامل. يُروى خليط التفاعل بإضافة حمض الأوكسيليك أحادي الضرس ببطء، حتى يصل الأسي من المحلل إلى أربعة تقريباً. الآن، استخراج محلول عازلة مطفأة مع اثنين من لترات من اللامائية، خالية من البيروكسيد دييثيل الأثير.
استخدم قمعًا فاصلًا لزعزعة الطبقات وفصلها، وجمع الأثير في قارورة Erlenmeyer. كرر مرتين إضافيتين، وإضافة ما يقرب من 50 غراما من كبريتات المغنيسيوم اللامائية لتجفيف الأثير. على قمع تصفية فراغ، صب الأثير المجفف لتصفية كبريتات المغنيسيوم، ونقل طبقة الأثير المصفاة إلى قارورة مستديرة القاع من المبخر الدوار.
ضبط سرعة دوران إلى متوسطة، وبدء الفراغ لتركيز السائل على إنتاج بقايا EDP الخام. قم بتحميل البقايا في خرطوشة سيليكا 40 جرامًا لإجراء كروماتوغرافيا عمود فلاش باستخدام آلة تنقية وميض تلقائية. تبدأ في 10٪ خلات إيثيل في سداسيات، وتتصاعد تصل إلى 60٪ خلات إيثيل في سداسيات على مدى 22 دقيقة.
يتم جمع الكسور تلقائيا في الأنابيب. ثم، والجمع بين الكسور من كل قمة في قارورة مستديرة القاع، وضعت على المبخر الدوارة، وبدء التبخر. يتم الحصول على ثلاثة أجزاء، إدارة الشؤون الإنسانية، ايزومرات EDP، و diepoxide.
لestrify 0.151 غراما من epoxide، في قارورة مستديرة القاع أو قارورة صغيرة، إضافة ملليلتر اثنين من الميثانول اللامائية وثلاثة ملليلترات من التولوين اللامائية، وإضافة شريط ضجة. ربط قارورة مع بالون مليئة الأرجون من خلال الحاجز المطاطي وإبرة، وإضافة 0.26 ملليلتر من اثنين من المولور TMS-diazomethane من خلال حقنة أثناء التحريك. انتظر 10 دقائق، وإضافة 05 ملليلتر إضافية من TMS-diazomethane حتى يظهر لون أصفر باهت.
بعد 30 دقيقة، والتركيز بعناية الخليط باستخدام المبخر الدوارة، واستخدام 40 غرام هلام السيليكا خرطوشة العمود على آلة كروماتوغرافيا فلاش لتنقية المخلفات. Elute مع تركيز متساوي الراسمي من 4٪ خلات الإيثيل في سداسيات أكثر من 22 دقيقة. جمع الكسور التي تحتوي على 19S المنقاة، 20R-EDP ميثيل استر يُستجد أولاً، تليها 16S، 17R-EDP ميثيل إستر.
الآن، تقييم الكسور حسب طبقة رقيقة من الكروماتوغرافيا في خليط هيكسان إلى إثيل-خلات من ثمانية إلى واحد. وصمة عار مع برمنغنات البوتاسيوم للتحقق من وجود أي كسور مختلطة تحتوي على كل من الأيزومرات. تركيز الكسور المقابلة لكل قمة على المبخر الدوارة، ومن ثم تزن على التوازن لتحديد كمية استرات EDP التي تم الحصول عليها.
إذا بقيت الكسور المختلطة، إعادة اللون لهم مع نفس نظام المذيبات كما كان يستخدم سابقا. تركيز كل كسر يحتوي على كل regioisomer الفردية على المبخر دوارة. لتحويل الفردية EDP استر regioisomers إلى أشكال حمضهم، وتمييع استر EDP في قارورة صغيرة مع ما يقرب من 0.7 ملليلتر من THF لكل 0.1 ملليمول من استر، جنبا إلى جنب مع 0.175 ملليلتر من الماء.
تبريد القارورة إلى الصفر درجة مئوية في حمام الثلج، إضافة ثلاثة ما يعادل محلول هيدروكسيد الليثيوم، ويحرك على لوحة ضجة تحت الأرجون بين عشية وضحاها في حين الاحترار إلى درجة حرارة الغرفة. في الصباح ، يطفئ التفاعل بإضافة حمض الفورميك ببطء ، حتى يصل درجة الحموضة في الخليط إلى ثلاثة إلى أربعة. ثم، إضافة الماء واثنين من ملليلتر من خلات الإيثيل لفصل الطبقات.
استخراج طبقة المياه مع 10 ملليلتر من خلات الإيثيل ثلاث مرات، وغسل مع 20 ملليلتر من محلول ملحي المشبعة، وإضافة عدة غرامات من كبريتات الصوديوم اللامائية في محلول لتجفيف طبقة خلات الإيثيل. تركيز خلات الإيثيل حل باستخدام المبخر الدوارة، إضافة 10 ملليلتر من سداسيات، والتركيز مرة أخرى. كرر مرتين لإزالة azeotropically حمض الفورميك المتبقية.
تنقية بقايا بواسطة الكروماتوغرافيا العمود فلاش، مسيل مع 10 إلى 30٪ خلات إيثيل أكثر من 15 دقيقة. تركيز الكسور المطلوبة في المبخر الدوار، وجافة في vacuo لتحمل حمض النقية. يظهر الكروم العمود فلاش التي تم الحصول عليها عند تنقية الخليط الخام من إبوكسيد الأنزيمية هنا.
تم الحصول على ثلاث قمم رئيسية ، مُمَرَّجة في ترتيب ، أولاً ، DHA غير مُجَدَّد ، ثانياً ، خليط من ايزومرات EDP ، وثالثاً ، diepoxide ، وهي منتجات عادية للأكسدة المفرطة. وبعد استر الستيرة وفصل الوزمات الوريجيو، تشير أطياف البروتون NMR إلى أنه تم الحصول على استرات ميثيل 16S و17R-EDP و 19S و 20R-EDP. وأكد Chiral HPLC النقاء enantiomeric من أشكال حمض من EDPs.
تأكد من الحفاظ على مرق الخاص معقمة أثناء التعامل مع وتطعيم لتجنب التلوث. ويمكن استخدام إبوكسيديشن للأحماض الدهنية الأخرى. لذلك حاولنا أيضا مع الأحماض arachidonic وeicosapentaenoic، وحصلنا على غلة جيدة من تلك الإكسيدات إينانتيوبر، لذلك 14، 15-EET و 17، 18-EEQ.
لذلك فإن البروتوكول الذي يسمح للباحثين بالوصول إلى الأحماض الدهنية الإيبوكسي قد يساعد في الأبحاث على الوظائف البيولوجية لهذه المركبات ، والتي يمكن أن تؤدي إلى استخدامها كدواء يؤدي. والمواد الكيميائية الخطرة هي PMSF، وهي خطرة عن طريق الاتصال، و TMS-diazomethane، وهي سامة جدا عن طريق الاتصال والاستنشاق. لذلك ينبغي أن تستخدم هذه الأخيرة في غطاء الدخان ومع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
