סינתזה אנזימטית של אפוקסי מטבוליטים של דוקוסקסהקאקאנוק, אייאיסאופנטנואית וחומצות ארכידונית

אז הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו להכין חומצות שומן אפוקסי enantiopure, שיטה זו עשויה לעזור לקדם מחקר על המנגנונים שבהם מטבוליטים אלה פועלים בגוף. מבחינה היסטורית, חומצות שומן אפוקסי טהור קשה מאוד להשיג. אז הפרוטוקול שלנו הוא פשוט, מהיר, חסכוני, וזה מאפשר לנו להכין כמויות משמעותיות של מטבוליטים אלה.

כן, פיתחנו פרוטוקול עבור DHA, אבל זה גם עובד טוב מאוד עבור המשרד לאיכות הסביבה וחומצה רחידונית. עבוד במהירות, מכיוון שחלק מהרהגנטים רגישים לאוויר, במיוחד DHA ו- NADPH, ו הקפד לשייך הכל מראש כך שההגדרה תהיה פשוטה. כמו כן, להיות מודעים לסכנות.

הפרוטוקול שלנו משתמש בטכניקות הן באנזימולוגיה והן בכימיה אורגנית. הדמיה היא קריטית כדי לסייע לקוראים וצופים שאינם מכירים את הטכניקות המיוחדות בתחומים אלה. כדי לחסן, להשתמש בלולאה סטרילית או פיפטה טבול במלאי גליצרול של pBS-BM3 הפך DH5-אלפא E.coli לתוך חמישה מיליליטר של מרק LB סטרילי בתוספת 0.5 מיליגרם של אמפיצילין.

הדגירה את תרבות התא בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ב 200 סל"ד. לאחר מכן, מוסיפים את תרבות המתנע של חמישה מיליליטר ו -100 מיליגרם של אמפיצילין לליטר אחד של מרק LB סטרילי בבקבוק ארלנפייר. לנער ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות ב 200 סל"ד, ולאחר מכן ב 30 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות ב 200 סל"ד.

לאחר מכן, לאסוף את תרבות התא לתוך צינורות צנטריפוגה, צנטריפוגה את תרבות התא בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 1, 000 פעמים g. יוצקים את העל-טבעי לתוך בקבוקון אחר. לטהר עם אקונומיקה או באמצעות autoclave, ולאחסן את גלולת התא במינוס 78 מעלות צלזיוס עד טיהור אנזים.

כדי לבצע תזה תא, תחילה להפשיר את גלולת התא על קרח, ולתלות מחדש 40 מיליליטר של חיץ מסיסות קר כקרח המכיל טריס, PMSF, ו EDTA. בעוד על קרח, sonicate התאים במשך דקה אחת עם homogenizer קולי, עם הגדרת כוח פלט של 10 וחובת 100, ואחריו הפסקה של דקה אחת על הקרח על מנת ללטף את התאים. חזור על הליך זה שש פעמים.

צנטריפוגה התא lysate בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב 11, 000 פעמים g כדי גלולה פסולת התא. כדי לבצע כרומטוגרפיה של זיקה, בחדר קר או במקרר עם דלת הזזה, בארבע מעלות צלזיוס, הכינו תחילה עמוד כרומטוגרפיה חזק של חילופי אניון על ידי שטיפת השרף עם חמישה כרכים של חיץ A של טריס 10 מילימולר ב- pH 7.8. לאחר מכן, הוסף את העל-טבעי של lysates התא לעמודה שיווי משקל, ולשטוף את העמודה עם שלושה כרכים עמודה של מאגר קר A.Then, להשתיק את BM3 על ידי שטיפת העמודה עם שישה כרכים עמודה של מאגר קר B של טריס 10-מילימולר ו 600 מילימולר נתרן כלוריד.

לאסוף את שבר אלונט אדמדם-חום. אם החלבון אינו בשימוש מיידי, מערבבים אותו עם נפח שווה של גליצרול, והבזק להקפיא עם חנקן נוזלי. אחסן את הפתרון הקפוא במינוס 78 מעלות צלזיוס.

כדי לבצע אפוקסידציה של DHA, תחילה לקבוע את הריכוז של אנזים BM3 מופשר, על פי שיטת בדיקה ספקטרלית חד תחמוצת הפחמן dithionite. לאחר מכן, ב beaker המכיל שני ליטרים של חיץ תגובה להיות מעורבב על צלחת ערבוב מגנטי, להוסיף 0.94 מילימולים של DHA מדולל 18.8 מיליליטר של DMSO ואת האנזים BM3 מדולל 20 nanomolar. בעוד הפתרון הוא ערבוב, להתחיל את תגובת אפוקסידציה על ידי הוספת 8.7 מיליליטר של חיץ התגובה המכיל 0.94 מילימולים של NADPH.

מערבבים את התגובה במשך 30 דקות תוך מבעבע אוויר לתוך תערובת התגובה עם בלון מלא אוויר מחובר מזרק ומחט מודבק לתוך הקנומה. לאחר מכן, לצייר מיקרוליטר אחד של תערובת התגובה, ולשים אותו לתוך ספקטרופוטומטר NanoDrop כדי למדוד את הספיגה ב 340 ננומטר. השתמש במים כריק.

אם אין ספיגה שנותרה, מה שמצביע על NADPH כבר נצרך, התגובה הושלמה. מרווה את תערובת התגובה על ידי הוספה איטית של חומצה אוקסלית טוחנית אחת dropwise, עד pH של הפתרון מגיע כארבעה. עכשיו, לחלץ את פתרון חיץ מרווה עם שני ליטרים של אתר דיתיל נטול חמצן נטול חמצן.

השתמש משפך הפרדה לנער ולהפריד את השכבות, ולאסוף את האתר לתוך בקבוק Erlenmeyer. חוזרים על הפעולה פעמיים נוספות ומוסיפים כ-50 גרם מגנזיום גופרתי נטול מים לייבוש האתר. על משפך מסנן ואקום, יוצקים את האתר המיובש כדי לסנן את המגנזיום גופרתי, ומעבירים את שכבת האתר המסוננת לבקבוק תחתון עגול של האידוי הסיבובי.

כוונן את מהירות הסיבוב לבינונית, והתחל את הוואקום כדי לרכז את הנוזל להניב שאריות EDP גולמיות. טען את השאריות במחסנית סיליקה של 40 גרם כדי לבצע כרומטוגרפיה של עמודת הבזק באמצעות מכונת טיהור פלאש אוטומטית. התחל ב- 10%ethyl אצטט בהקסאן והגדל עד 60% אתיל אצטט בהקסאן במשך 22 דקות.

השברים נאספים באופן אוטומטי בצינורות. לאחר מכן, לשלב את השברים מכל שיא לתוך בקבוקון עגול למטה, לשים על אידוי סיבובי, ולהתחיל את האידוי. שלושה שברים מתקבלים, DHA, אייסומרים EDP, ו diepoxide.

כדי להבליט את 0.151 גרם של אפוקסיד, בבקבוקון עגול למטה או בקבוקון קטן, להוסיף שני מיליליטר של מתנול נטול מים ושלושה מיליליטר של טולואן נטול מים, ולהוסיף בר ערבוב. חבר את הבקבוק עם בלון מלא ארגון דרך מחיצת גומי ומחט, ולהוסיף 0.26 מיליליטר של שני טוחנת TMS-diazomethane דרך מזרק תוך ערבוב. המתן 10 דקות והוסף 05 מיליליטר נוספים של TMS-diazomethane עד שיופיע צבע צהוב חיוור.

לאחר 30 דקות, לרכז בזהירות את התערובת באמצעות אידוי סיבובי, ולהשתמש 40 גרם ג'ל סיליקה עמוד מחסנית על מכונת כרומטוגרפיה פלאש כדי לטהר את השאריות. אלוט עם ריכוז isocratic של 4% אתיל אצטט בהקסאן מעל 22 דקות. לאסוף את השברים המכילים את מטוהרים 19S, 20R-EDP מתיל אסתר מרומם הראשון, ואחריו 16S, 17R-EDP מתיל אסתר.

עכשיו, להעריך את השברים על ידי כרומטוגרפיה שכבה דקה בתערובת הקסאן-לאתיל-אצטט שמונה לאחד. כתם עם אשלגן פרמנganate כדי לבדוק אם יש שברים מעורבים המכילים את שני האיזומרים. לרכז את השברים המתאימים לכל שיא על אידוי סיבובי, ולאחר מכן לשקול איזון כדי לקבוע את כמות ESTERS EDP שהושגו.

אם נשארים שברים מעורבים, יש להפוך אותם מחדש לאותה מערכת ממסים כפי שהיה בשימוש בעבר. לרכז כל שבר המכיל את regioisomer בודדים על אידוי סיבובי. כדי להמיר regioisomers מתיל אסתר EDP בודדים לצורות החומצה שלהם, לדלל את אסתר EDP בבקבוקון קטן עם כ 0.7 מיליליטר של THF לכל 0.1 מילימולים של אסתר, יחד עם 0.175 מיליליטר של מים.

מקררים את הבקבוקון לאפס מעלות צלזיוס באמבט קרח, מוסיפים שלוש שוות ערך לתסכול ליתיום הידרוקסידי, ומערבבים על צלחת ערבוב מתחת לארגון במהלך הלילה תוך התחממות לטמפרטורת החדר. בבוקר, מרווה את התגובה על ידי הוספה איטית של חומצה פורמית, עד שה- pH של התערובת מגיע לשלוש עד ארבע. לאחר מכן, מוסיפים מים ושני מיליליטר של אתיל אצטט כדי להפריד את השכבות.

מוציאים את שכבת המים עם 10 מיליליטר של אתיל אצטט שלוש פעמים, לשטוף עם 20 מיליליטר של תווי מלח רוויים, ולהוסיף כמה גרם של נתרן גופרתי נטול מים בתסומה לייבוש שכבת האתיל אצטט. לרכז את פתרון האתיל אצטט באמצעות אידוי סיבובי, להוסיף 10 מיליליטר של הקסנים, ולהתרכז שוב. חזור פעמיים כדי להסיר azeotropically חומצה פורמית שיורית.

לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה של עמודת פלאש, eluting עם 10 עד 30% אתיל אצטט על פני 15 דקות. לרכז את השברים הרצויים מאייד סיבובי, ויבש vacuo כדי להרשות לעצמם את החומצה המטוהרת. הכרומטוגרמה של עמודת הפלאש המתקבלת עם טיהור התערובת הגולמית מאפסידציה אנזימטית מוצגת כאן.

שלוש פסגות עיקריות הושגו, eluting בסדר של, הראשון, DHA unreacted, השני, תערובת של איזומרים EDP, ושלישית, diepoxide, שהם מוצרי חמצון יתר נורמלי. לאחר אסתריות והפרדה של regioisomers, ספקטרום NMR פרוטון עולה כי טוהר גבוה 16S, 17R-EDP ו 19S, אסטרים מתיל 20R-EDP הושגו. כיראל HPLC אישר טוהר אננטיומרי של צורות החומצה של EDPs.

הקפד לשמור על המרק שלך סטרילי תוך כדי טיפול וחינוך כדי למנוע זיהום. אפוקסידציה יכול לשמש חומצות שומן אחרות. אז ניסינו את זה גם עם חומצות ארכואידיות ואיקוספנטאנואיות, והשגנו תשואות טובות של אפוקסידים enantiopure אלה, כך 14, 15-EET ו 17, 18-EEQ.

אז פרוטוקול המאפשר לחוקרים לגשת חומצות שומן אפוקסי עשוי לסייע במחקר על הפונקציות הביולוגיות של תרכובות אלה, אשר יכול להוביל את השימוש בהם כמוביל סמים. הכימיקלים המסוכנים הם PMSF, אשר מסוכן על ידי מגע, ו TMS-diazomethane, אשר רעיל מאוד על ידי מגע שאיפה. אז האחרון צריך לשמש ברדס אדים עם ציוד מגן אישי נאות.