Таким образом, наш протокол позволяет нам подготовить энантиопуры эпоксидной жирных кислот, и этот метод может помочь продвинуть исследования механизмов, с помощью которых эти метаболиты действуют в организме. Исторически сложилось так, что чистые эпоксидные жирные кислоты очень трудно получить. Таким образом, наш протокол прост, быстр, рентабельн, и позволяет нам подготовить значительное количество этих метаболитов.
Да, мы разработали протокол для ДГК, но он также работает очень хорошо для EPA и арахидоновой кислоты. Работа быстро, так как некоторые из реагентов чувствительны к воздуху, в частности DHA и NADPH, и не забудьте спарить все заранее, так что установка проста. Кроме того, быть в курсе опасностей.
Наш протокол использует методы как в энзимологии, так и в органической химии. Визуализация имеет решающее значение для оказания помощи читателям и зрителям, которые не знакомы со специализированными методами в этих областях. Чтобы привить, используйте стерильную петлю или пипетку, смоченной в запасе глицерола pBS-BM3, трансфицированного DH5-альфа E.coli в пять миллилитров стерильного бульона LB, дополненного 0,5 миллиграммами ампициллина.
Инкубировать клеточной культуры в шейкер при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов при 200 об/мин. Затем добавьте пятимиллилитровую культуру стартера и 100 миллиграммов ампициллина в один литр стерильного бульона LB в колбе Эрленмейера. Встряхните при 37 градусах по Цельсию в течение шести часов при 200 об/мин, затем при 30 градусах по Цельсию в течение 18 часов при 200 об/мин.
После этого соберите культуру клеток в центрифуги трубы, и центрифуга клеточной культуры при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут при 1000 раз г. Слейте супернатант в другую колбу. Обеззараживать отбеливателем или с помощью автоклава, и хранить гранулы клетки при температуре минус 78 градусов по Цельсию до очистки ферментов.
Для выполнения клеточного лиза сначала оттаивать клеточные гранулы на льду и повторно использовать 40 миллилитров ледяного буфера solubilization, содержащего Tris, PMSF и EDTA. Находясь на льду, sonicate клеток в течение одной минуты с ультразвуковым гомогенизатором, с выходной мощности настройки 10 и долг 100, а затем одну минуту перерыва на льду, с тем чтобы подонизить клетки. Повторите эту процедуру шесть раз.
Центрифуга клетки лисировать при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут при 11000 раз г гранулировать клеточный мусор. Для выполнения сродства хроматографии, в холодной комнате или холодильнике с раздвижной дверью, при четырех градусах Цельсия, сначала подготовьте сильный анионный обмен хроматографической колонкой путем мытья смолы с пятью объемами колонки буфера А 10-миллимолярной трис при рН 7.8. Далее добавьте супернатант клетки лизирует к уравновешенной колонке и вымойте колонку тремя объемами столбца холодного буфера A.Then, утешайте BM3, промыв колонку шестью объемами столбца холодного буфера B 10-миллимоляонных три и 600-миллимолярского хлорида натрия.
Соберите красновато-коричневую элюентную фракцию. Если белок используется не сразу, смешайте его с равным объемом глицерола и заморозьте жидкостью. Храните замороженный раствор при температуре минус 78 градусов по Цельсию.
Для выполнения эпоксидации ДГК, сначала определить концентрацию оттаявого фермента BM3, в соответствии с дитионитом угарного газа спектрального метода анализа. Затем в стакан, содержащий два литра реакционной буфера, перемешиваемой на магнитной пластине перемешивания, добавьте 0,94 миллимолета ДГК, разбавленного в 18,8 миллилитров DMSO, и фермент BM3, разбавленный до 20 наномолярных. Пока раствор шевелится, начните реакцию эпоксидации, добавив 8,7 миллилитров буфера реакции, содержащего 0,94 миллимоля NADPH.
Перемешать реакцию в течение 30 минут, в то время как восходящей воздуха в реакционной смеси с воздуха заполненные воздушный шар прилагается к шприцу и иглы приклеены к внутренней части стакана. После этого нарисуйте один микролитер реакционной смеси и поместите его в спектрофотометр NanoDrop для измерения поглощения на 340 нанометров. Используйте воду в качестве пробела.
Если нет оставшегося поглощения, что указывает на то, что NADPH был поглощен, реакция завершена. Утолить реакционной смеси, медленно добавляя одномолярной щавелевой кислоты dropwise, пока рН раствора достигает примерно четырех. Теперь добыть затухаемый буферный раствор с двумя литрами ангидроуса, без перекиси дитил эфира.
Используйте сепараторную воронку, чтобы встряхнуть и отделить слои, и собрать эфир в колбу Эрленмайера. Повторите еще два раза, и добавить около 50 граммов сульфата ангидроза магния, чтобы высушить эфир. На воронку вакуумного фильтра вылейте высушенный эфир для фильтрации сульфата магния и перенесите фильтрованный слой эфира в круглую нижнюю колбу роторного испарителя.
Отрегулируйте скорость вращения до средней и запустите вакуум, чтобы сконцентрировать жидкость, чтобы дать сырой остаток EDP. Загрузите остаток в 40-граммовый кремнеземный картридж для выполнения хроматографии флэш-колонки с помощью автоматизированной машины для очистки вспышки. Начните с 10%этилового ацетата в гексанах, и нарастить до 60% этилового ацетата в гексанах в течение 22 минут.
Фракции автоматически собираются в трубках. Затем объединить фракции с каждого пика в колбу круглого дна, положить на роторный испаритель, и начать испарение. Три фракции получены, DHA, EDP изомеры, и диэпоксид.
Чтобы вылмить полученный 0,151 грамма эпоксида, в колбу с круглым дном или небольшой флакон, добавить два миллилитров метанола ангидроуса и три миллилитров толюола, и добавить перемешать бар. Соедините колбу с шариком, наполненным аргоном через резиновую перегородку и иглу, и добавьте 0,26 миллилитров двухмяльного TMS-диазометан через шприц, помешивая. Подождите 10 минут и добавьте еще 05 миллилитров ТМС-диазометан до тех пор, пока не появится бледно-желтый цвет.
Через 30 минут, тщательно сконцентрировать смесь с помощью роторного испарителя, и использовать 40-граммовый кремнезем гель колонки картриджа на флэш хроматографии машины для очистки остатков. Элют с изократической концентрацией 4%этилового ацетата в гексанах в течение 22 минут. Соберите фракции, содержащие очищенные 19S, 20R-EDP метиловый эстер элуаты первый, а затем 16S, 17R-EDP метиловый эстер.
Теперь оцените фракции по тонкослойной хроматографии в смеси шести-к-одному шестиугольник-этил-ацетат. Пятно с перманганатом калия, чтобы проверить на наличие смешанных фракций, содержащих оба изомеров. Сосредоточьте фракции, соответствующие каждому пику, на вращающемся испарительном средстве, а затем взвесь на балансе, чтобы определить количество полученных эфиров EDP.
Если смешанные фракции остаются, повторно хроматограф их с той же системой растворителя, как ранее использовали. Сосредоточьте каждую фракцию, содержащую отдельный ретиоизомер, на роторном испарительном. Для преобразования отдельных EDP метилэстр regioisomers в их кислотных форм, разбавить эстер EDP в небольшой флакон с примерно 0,7 миллилитров THF на 0,1 миллимолей эстера, а также 0,175 миллилитров воды.
Охладить флакон до нуля градусов по Цельсию в ледяной ванне, добавить три эквивалента раствора гидроксида лития, и перемешать на пластине перемешать под аргоном на ночь при потеплении до комнатной температуры. Утром, утолить реакцию, медленно добавляя фамическую кислоту, пока рН смеси достигает трех-четырех. Затем добавьте воду и два миллилитров этилового ацетата, чтобы отделить слои.
Извлекайте слой воды с 10 миллилитров этилового ацетата три раза, промойте 20 миллилитров насыщенного раствора рассола и добавьте несколько граммов ангидроса сульфата натрия в раствор для высыхания этилового ацетата слоя. Сосредоточьте раствор этилового ацетата с помощью роторного испарителя, добавьте 10 миллилитров гексан и снова сосредоточьтесь. Повторите дважды, чтобы азеотропно удалить остаточную formic кислоты.
Очистить остатки с помощью флэш-колонки хроматографии, eluting с 10 до 30% этилового ацетата в течение 15 минут. Сосредоточьте нужные фракции в роторном испарительном и высушите в вакуо, чтобы позволить себе очищенную кислоту. Здесь показана хроматограмма флеш-столба, полученная при очистке сырой смеси от энзиматической эпоксидации.
Три основных пика были получены, eluting в порядке, во-первых, нереактированных ДГК, во-вторых, смесь изомеров ЭДП, и, в-третьих, диэпоксид, которые являются нормальными продуктами чрезмерного окисления. После эфирификации и разделения ретиоизомеров, протонные спектры ЯМР указывают на то, что были получены метиловые эфиры высокой чистоты 16S, 17R-EDP и 19S, 20R-EDP метиловые эфиры. Чирал HPLC подтвердил энантиометрической чистоты кислотных форм ЭАП.
Будьте уверены, чтобы сохранить ваш бульон стерильным при обработке и инокуляции, чтобы избежать загрязнения. Эпоксидирование может быть использовано для других жирных кислот. Таким образом, мы также попробовали его с арахидоновой и эйкозапентаеноидных кислот, и мы получили хорошие урожаи этих энантиопуре эпоксидов, так что 14, 15-EET и 17, 18-EE.
Таким образом, протокол, который позволяет исследователям получить доступ к эпоксидной жирных кислот может помочь в исследовании биологических функций этих соединений, которые могут привести к их использованию в качестве наркотиков приводит. Опасными химическими веществами являются ПМСФ, которые опасны при контакте, и ТМС-диазометан, который очень токсичен при контакте и вдыхании. Таким образом, последний должен быть использован в дым капот и с надлежащей личной защиты оборудования.
