したがって、私たちのプロトコルは、エアンチオピュールエポキシ脂肪酸を調製することができ、この方法は、これらの代謝産物が体内で作用するメカニズムに関する研究を進めるのに役立つかもしれません。歴史的に、純粋なエポキシ脂肪酸は非常に入手が困難である。したがって、私たちのプロトコルはシンプルで迅速で費用対効果が高く、大量の代謝物を準備することができます。
はい、DHAのプロトコルを開発しましたが、EPAやアラキドン酸にも非常にうまく機能します。試薬の一部は空気に敏感で、具体的にはDHAとNADPHであるため、セットアップが簡単になるように事前にペアリングしてください。また、危険に注意してください。
私たちのプロトコルは、酵素学と有機化学の両方の技術を使用しています。視覚化は、これらの分野の特殊な手法に精通していない読者や視聴者を支援するために重要です。接種するには、0.5ミリグラムのアンピシリンを補充した無菌LBスープの5ミリリットルにpBS-BM3トランスフェクションDH5アルファ大腸菌のグリセロールストックに浸した無菌ループまたはピペットを使用してください。
200rpmで24時間37°Cのシェーカーで細胞培養をインキュベートする。その後、5ミリリットルのスターター培養と100ミリグラムのアンピシリンを、エルレンマイヤーフラスコの無菌LBスープ1リットルに加えます。摂氏37度で200rpmで6時間振り、200rpmで摂氏30度で18時間振ります。
その後、遠心分離チューブに細胞培養物を集め、1,000倍gで10分間摂氏4度で遠心分離する。上清を別のフラスコに注ぎます。漂白剤で除染するか、オートクレーブを使用し、酵素精製まで細胞ペレットをマイナス78°Cで保存します。
細胞溶解を行うために、まず氷上の細胞ペレットを解凍し、トリス、PMSF、およびEDTAを含む氷冷可溶化バッファーの40ミリリットルで再懸濁する。氷の上で、超音波ホモジナイザーで1分間細胞を超音波処理し、出力電力設定は10、デューティは100で、続いて細胞をライスするために氷の上で1分間の休憩を取ります。この手順を 6 回繰り返します。
細胞の残骸をペレットに11,000倍gで30分間摂氏4度で遠心分離する。アフィニティクロマトグラフィーを行うために、冷たい部屋または冷蔵庫に、摂氏4度で、まずpH 7.8で10ミリモルトリスのバッファーAの5カラム体積の樹脂を洗浄することによって強力なアニオン交換クロマトグラフィーカラムを準備する。次に、細胞ライゼートの上清を平衡カラムに加え、冷たい緩衝液Aの3カラム体積でカラムを洗浄し、10ミリモルトリスと600ミリモル塩化ナトリウムの6カラム量のコールドバッファーBでカラムを洗浄してBM3を溶出させる。
赤褐色の溶出分率を収集します。すぐに使用されていない場合は、グリセロールの等量と混合し、液体窒素とフラッシュフリーズします。凍結した溶液をマイナス78°Cで保存します。
DHAのエポキシ化を行うために、まず解凍されたBM3酵素の濃度を決定し、一酸化炭素ジチオン酸スペクトルアッセイ法に従う。次に、磁気攪拌板上で撹拌される2リットルの反応バッファーを含むビーカーに、DMSOの18.8ミリリットルに希釈したDHAの0.94ミリモルを加え、BM3酵素を20ナノモルに希釈した。溶液が攪拌している間に、NADPHの0.94ミリモルを含む反応バッファーの8.7ミリリットルを加えることによってエポキシ化反応を開始する。
シリンジに取り付けられた空気で満たされた風船とビーカーの内側にテーピングされた針で反応混合物に空気を泡立てながら、反応を30分間かき混ぜます。その後、反応混合物の1マイクロリットルを引き上げ、340ナノメートルで吸光度を測定するためにNanoDrop分光光度計に入れます。水をブランクとして使用します。
残りの吸光度が存在しない場合は、NADPH が消費されたことを示す、反応が完了します。反応混合物を滴下してゆっくりと1モルのシュウ酸を加えることによって、溶液のpHが約4に達するまで焼入れる。次に、2リットルの無水、過酸化物を含まないジエチルエーテルでクエンチバッファー溶液を抽出します。
セパレート漏斗を使用して層を振り、分離し、エーテルをエルレンマイヤーフラスコに集めます。さらに2回繰り返し、約50グラムの無水硫酸マグネシウムを加えてエーテルを乾燥させます。真空フィルター漏斗上で、乾燥したエーテルを注ぎ、硫酸マグネシウムを濾過し、濾過したエーテル層をロータリーエバポレーターの丸底フラスコに移します。
回転速度を中型に調整し、液体を濃縮して粗いEDP残渣を得るように真空を開始します。残渣を40グラムのシリカカートリッジにロードし、自動フラッシュ精製機を使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーを実行します。ヘキサンで酢酸エチル10%から開始し、22分間にわたってヘキサンで60%酢酸エチルまでランプアップします。
分数はチューブに自動的に集められます。次に、各ピークからの分数を丸底フラスコに組み合わせ、ロータリーエバポレーターに乗せて、蒸発を開始します。3つの画分が得られる、DHA、EDP異性体、及びジポキシド。
得られた0.151グラムのエポキシドをエステル化するには、丸底フラスコまたは小さなバイアルに、無水メタノール2ミリリットルと無水トルエン3ミリリットルを加え、攪拌棒を加える。ゴム中隔と針を通してアルゴンで満たされた風船とフラスコを接続し、攪拌しながら注射器を介して2モルTMSジアゾメタンの0.26ミリリットルを追加します。10分間待ち、淡い黄色が表示されるまでTMS-ジアゾメタンを05ミリリットル追加します。
30分後、ロータリーエバポレーターを使用して慎重に混合物を濃縮し、40グラムのシリカゲルカラムカートリッジをフラッシュクロマトグラフィーマシンに使用して残渣を精製します。22分間にわたってヘキサン中に4%酢酸エチルのイソクラティック濃度を有するエルテ。精製した19S、20R-EDPメチルエステルを含む画分を最初に集め、続いて16S、17R-EDPメチルエステルを回収する。
さて、8対1のヘキサン対エチル酢酸混合物中の薄層クロマトグラフィーによる分数を評価する。過マンガン酸カリウムを含む染色物は、両方の異性体を含む任意の混合分画をチェックする。各ピークに対応する分率をロータリーエバポレーターに濃縮し、次いでバランスをとって得られるEDPエステルの量を求めます。
混合画分が残っている場合は、以前使用したのと同じ溶媒系でそれらを再クロマトグラフ化します。個々のレジオイソーマーを含む各分画をロータリーエバポレーターに濃縮する。個々のEDPメチルエステルレジオアイマーを酸形態に変換するには、EDPエステルを0.1ミリモルあたり約0.7ミリリットルのTHFで小さなバイアルで希釈し、0.175ミリリットルの水と一緒に希釈します。
氷浴でバイアルを摂氏0度に冷却し、水酸化リチウム溶液の3つの同等物を加え、室温に温めながら一晩アルゴンの下でかき混ぜる。朝、酸性ギ酸を徐々に加えて反応を焼き付け、混合物のpHが3~4に達するまで。その後、水と酢酸エチル2ミリリットルを加え、層を分離する。
10ミリリットルの酢酸エチルで水層を3回抽出し、20ミリリットルの飽和塩水溶液で洗浄し、溶液中に数グラムの無水硫酸ナトリウムを加えて酢酸エチル層を乾燥させる。ロータリーエバポレーターを使用して酢酸エチル溶液を濃縮し、ヘキサンを10ミリリットル加え、再び濃縮します。残留ギ酸を熱帯に除去するために2回繰り返す。
残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、15分間にわたって酢酸エチルを10~30%溶出する。目的の分画をロータリーエバポレーターに濃縮し、真空中で乾燥させて精製された酸を得る。酵素的エポキシ化から粗混合物を精製した際に得られたフラッシュカラムクロマトグラムをここに示す。
3つの主要なピークが得られた、第1、未反応のDHA、第2、EDP異性体の混合物、及び、第3に、正常過酸化生成物であるジエポキシドの順に溶出する。レギオアイソームのエステル化および分離後、プロトンNMRスペクトルは、高純度16S、17R-EDPおよび19S、20R-EDPメチルが得られたことを示す。キラルHPLCは、EDPの酸形態のエノミオマー純度を確認した。
汚染を避けるために取り扱い、接種しながら、あなたのスープを滅菌保つようにしてください。エポキシ化は、他の脂肪酸に使用することができる。そこで、アラキドン酸とエイコサペンタエン酸を使用して試し、エヌチオピュアエポキシドの収量が良くなったため、14、15-EET、17、18-EEQになりました。
したがって、研究者がエポキシ脂肪酸にアクセスすることを可能にするプロトコルは、これらの化合物の生物学的機能の研究に役立つ可能性があり、薬物リードとしての使用につながる可能性があります。有害な化学物質は接触によって危険なPMSFとTMS-ジアゾメタンであり、接触および吸入によって非常に有毒である。だから後者は、ヒュームフードと適切な個人的な保護具で使用する必要があります。
