因此，我们的协议允许我们准备环氧树脂脂肪酸，这种方法可能有助于推进研究这些代谢物在体内作用的机制。从历史上看，纯环氧脂肪酸是很难获得的。因此，我们的协议简单、快速、经济高效，它使我们能够准备大量的这些代谢物。
是的，我们为DHA开发了一个协议，但它也很好地适用于EPA和气酸。快速工作，因为某些试剂对空气敏感，特别是 DHA 和 NADPH，并且确保提前配对所有内容，以便设置简单。此外，请注意危险。
我们的协议在酶学和有机化学中均采用技术。可视化对于帮助不熟悉这些领域的专业技术的读者和观众至关重要。要接种，使用浸在pBS-BM3的甘油库存中的无菌循环或移液器将DH5-alpha大肠杆菌转化为5毫升的无菌LB汤，并辅以0.5毫克的安他西林。
在37摄氏度的摇床中孵育细胞培养，在200转/小时24小时。然后，在 Erlenmeyer 烧瓶中加入五毫升的开胃培养剂和 100 毫克的安皮西林，加入一升无菌 LB 肉汤中。在 37 摄氏度下在 200 rpm 下摇动 6 小时，然后在 30 摄氏度下摇动 18 小时，在 200 rpm 下摇动。
之后，将细胞培养收集到离心管中，在4摄氏度下将细胞培养离心10分钟，达到1000倍g。把上一液倒到另一个烧瓶里。用漂白剂或使用自洗器去污染，并在零下78摄氏度储存细胞颗粒，直到酶纯化。
要进行细胞解解，首先将细胞颗粒解冻在冰上，然后重新在含有Tris、PMSF和EDTA的40毫升冰冷溶解缓冲液中。在冰上，用超声波均质器对细胞进行声波化一分钟，输出功率设置为10，工作为100，随后在冰上休息一分钟，以对细胞进行分离。重复此过程六次。
将细胞在4摄氏度下离状30分钟，以11，000倍的g为单位，对细胞碎片进行颗粒。为了在4摄氏度的冷室或带滑动门的冰箱中进行亲和力色谱，首先在pH 7.8下用五列缓冲剂 A 的缓冲器 A 洗涤树脂，以四摄氏度为温度准备强的 Anion 交换色谱柱。接下来，将细胞的上清液添加到平衡柱中，用三列体积的冷缓冲液 A 洗涤柱，然后用六列体积的冷缓冲B洗涤，即10毫摩尔三酯和600毫摩尔氯化钠。
收集红褐色的水线分馏。如果蛋白质没有立即使用，则与等量的甘油混合，与液氮闪冻。将冷冻溶液存放在零下78摄氏度。
要对DHA进行环氧测量，首先根据一氧化碳二甲虫光谱测定法确定解冻BM3酶的浓度。然后，在含有两升反应缓冲液的烧杯中，加入0.94毫摩尔的DHA，稀释在18.8毫升的DMSO中，BM3酶稀释至20纳米摩尔。当溶液搅拌时，通过加入含有0.94毫摩尔的NADPH反应缓冲液8.7毫升开始环氧反应。
搅拌反应30分钟，同时将空气冒泡到反应混合物中，将充气气球连接到注射器上，并贴在烧杯内侧。之后，绘制一个微升的反应混合物，并放入NanoDrop分光光度计，以测量340纳米的吸光度。用水作为空白。
如果没有剩余的吸光度，表示 NADPH 已被消耗，则反应完成。通过缓慢地滴入一摩尔草酸，直到溶液的pH值达到大约4，使反应混合物被淬火。现在，用两升无水、无过氧化物的二乙醚提取淬火缓冲液。
使用分离漏斗摇动和分离层，并将乙醚收集到 Erlenmeyer 烧瓶中。重复两次，加入约50克无水硫酸镁以干燥乙醚。在真空过滤漏斗上，倒入干乙醚以过滤硫酸镁，并将过滤过的乙醚层转移到旋转蒸发器的圆底烧瓶中。
将旋转速度调整到中等，并启动真空，以浓缩液体，产生粗性EDP残留物。将残留物装入 40 克二氧化硅盒，使用自动闪存纯化机执行闪光柱色谱。从六烷中的10%乙酸乙酯开始，在22分钟内在六烷中增加至60%乙酸乙酸酯。
分数自动收集在管中。然后，将每个峰中的分数组合成一个圆底烧瓶，放在旋转蒸发器上，然后开始蒸发。获得三个分数，DHA，EDP异构体和二氧化物。
要将获得的0.151克环氧树脂酯化，在圆底烧瓶或小瓶中，加入两毫升无水甲醇和三毫升无水甲苯，并加入搅拌棒。通过橡胶隔膜和针头将装满砷的气球与烧瓶连接，并在搅拌时通过注射器加入 0.26 毫升的两摩尔 TMS-diazomethane。等待 10 分钟，再添加 05 毫升的 TMS-二丁氨酯，直到出现淡黄色。
30 分钟后，使用旋转蒸发器小心浓缩混合物，并使用闪光灯色谱机上的 40 克硅胶柱盒进行净化残留物。在六烷中等式浓度为4%乙酸的同位素浓度超过22分钟。首先收集含有纯化19S、20R-EDP甲酯甲酯的馏分，然后收集16S、17R-EDP甲基酯。
现在，通过八对一六烷到乙酸酯混合物中通过薄层色谱评估分数。用高锰酸钾染色，以检查是否含有两种异构物的任何混合馏分。将与每个峰值对应的分数集中在旋转蒸发器上，然后权衡平衡，以确定获得的 EDP 酯量。
如果混合馏分仍然存在，则使用与以前相同的溶剂系统重新色谱。将每个包含单个异构体的馏分集中在旋转蒸发器上。要将单个 EDP 甲基酯异构体转化为其酸形式，请用每 0.1 毫摩尔 0.1 毫摩尔的 EDP 酯以及 0.175 毫升的水稀释小瓶中的 EDP 酯。
在冰浴中将小瓶冷却到零摄氏度，加入三个当量为氢氧化锂溶液，并在加热至室温时在搅拌板下搅拌一夜。早晨，通过缓慢添加甲酸来淬火反应，直到混合物的pH值达到三到四。然后，加入水和两毫升乙酸乙酯分离层。
用10毫升乙酸酯萃取水层三次，用20毫升饱和盐水溶液清洗，并在溶液中加入几克无水硫酸钠，干燥乙酸乙酯层。使用旋转蒸发器浓缩乙酸乙酯溶液，加入 10 毫升六烷，然后再次浓缩。重复两次，以去除残留的甲酸。
通过闪光柱色谱净化残留物，用 10 到 30% 乙酸乙酯在 15 分钟内进行分离。将所需分数集中在旋转蒸发器中，并在真空中干燥，以提供纯化酸。此处显示了从酶环氧气纯化粗混合物时获得的闪光柱色谱图。
获得三个主要峰，第一，未反应的DHA，第二，EDP异构体的混合物，第三，二氧化二氮，这是正常的过度氧化产物。在异构体进行酯化和分离后，质子 NMR 光谱表明获得了高纯度16S、17R-EDP和19S、20R-EDP甲基酯。奇拉尔 HPLC 确认 EDP 的酸形式的异构纯度。
在操作和接种时，请务必保持肉汤无菌，以避免污染。环氧树脂可用于其他脂肪酸。因此，我们也尝试了与厌食素和二甲酸，我们获得了良好的产量，这些环氧树脂，所以14，15-EET和17，18-EEQ。
因此，一个允许研究人员获取环氧脂肪酸的协议可能有助于研究这些化合物的生物功能，这可能导致它们用作药物线索。危险化学品为接触危险性PMSF和接触和吸入性剧毒的TMS-二丁氨酯。因此，后者应用于烟罩和适当的个人防护设备。
