Yani protokolümüz enantiopure epoksi yağ asitleri hazırlamamıza izin verir ve bu yöntem bu metabolitlerin vücutta ki mekanizmaları üzerinde araştırma nın ilerlemesine yardımcı olabilir. Tarihsel olarak, saf epoksi yağ asitleri elde etmek çok zordur. Yani protokolümüz basit, hızlı, uygun maliyetli ve bu metabolitlerin önemli miktarda hazırlanmasını sağlıyor.
Evet, DHA için bir protokol geliştirdik, ama aynı zamanda EPA ve araşidonik asit için de çok iyi çalışıyor. Bazı reaktifler, özellikle DHA ve NADPH gibi hava duyarlı olduğundan, hızlı çalışın ve kurulum basit böylece önceden her şeyi eşleştirmek için emin olun. Ayrıca, tehlikelere dikkat edin.
Protokolümüz hem enzimoloji hem de organik kimya tekniklerini kullansın. Görselleştirme, bu alanlardaki özel tekniklere aşina olmayan okuyuculara ve görüntüleyenlere yardımcı olmak için çok önemlidir. Aşılamak için, steril bir döngü veya pipet pBS-BM3 transfected DH5-alfa E.coli gliserol stok batırılmış kullanın steril LB suyu beş mililitre içine 0.5 ampisilin miligram ile takviye.
Hücre kültürünü 37 derecede 200 rpm'de 24 saat boyunca bir çalkalayıcıyla kuluçkaya yatırın. Sonra, bir Erlenmeyer şişesinde steril LB suyu bir litre beş mililitre başlangıç kültürü ve ampisilin 100 miligram ekleyin. 200 rpm altı saat boyunca 37 derece santigrat çalkalayın, sonra 200 rpm 18 saat için 30 derece santigrat.
Bundan sonra, santrifüj tüpler ilerler ve 1,000 kez g 10 dakika boyunca dört santigrat derece hücre kültürünü santrifüj. Supernatant'ı başka bir şişeye dökün. Çamaşır suyu ile dekontamine veya otoklav kullanarak, ve enzim saflaştırma kadar eksi 78 santigrat derece hücre pelet saklayın.
Hücre lisisini gerçekleştirmek için, önce hücre peletini buz üzerinde eritin ve Tris, PMSF ve EDTA içeren 40 mililitre buz gibi solubilizasyon tamponu yla yeniden askıya alın. Buz üzerinde yken, ultrasonik homogenizer ile bir dakika boyunca hücreleri sonicate, bir çıkış gücü ayarı ile 10 ve görev 100, hücreleri lyse için buz üzerinde bir dakikalık mola takip. Bu yordamı altı kez tekrarlayın.
Hücre enkazını peletlemek için hücreyi 11,000 kez g'de 30 dakika boyunca 4 derecede nisbeten santrifüj edin. Afiyet kromatografisi gerçekleştirmek için, bir sürgülü kapı ile soğuk bir odada veya buzdolabında, dört derece santigrat, ilk pH 7.8 tampon A beş sütun hacimleri ile reçine yıkayarak güçlü bir aniyon değişimi kromatografi sütun hazırlamak. Daha sonra, hücre lysatt dengeli sütuna ekleyin ve soğuk tampon A.Then üç sütun hacimleri ile sütun yıkayın, 10-milimolar Tris ve 600 milimolar sodyum klorür soğuk tampon B altı sütun hacimleri ile sütun yıkayarak BM3 eute.
Kırmızımsı-kahverengi eluent fraksiyonu toplamak. Protein hemen kullanılıyorsa, eşit hacimli gliserol ile karıştırırımlayın ve sıvı nitrojenle flash- dondurun. Dondurulmuş çözeltiyi eksi 78 derecede saklayın.
DHA epoksidasyon gerçekleştirmek için, ilk çözülmüş BM3 enziminin konsantrasyonunu belirlemek, karbon monoksit dithionite spektral tsay yöntemine göre. Daha sonra, manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırılan iki litre reaksiyon tamponu içeren bir kabın içinde, DMSO 18,8 mililitre seyreltilmiş DHA 0.94 milimol ekleyin ve BM3 enzimi 20 nanomolar seyreltilmiş. Çözelti kıpırdanırken, NADPH 0.94 milimol içeren reaksiyon tampon 8.7 mililitre ekleyerek epoksidasyon reaksiyonu başlar.
Kabın içine bantlanmış bir şırınga ve iğneye bağlı hava dolu bir balonla reaksiyon karışımına hava köpürterken reaksiyonu 30 dakika karıştırın. Bundan sonra, reaksiyon karışımının bir mikrolitresini çizin ve 340 nanometrede emiciliği ölçmek için nanodrop spektrofotometreye koyun. Suyu boş olarak kullanın.
NADPH'nin tüketildiğini gösteren kalan bir emicilik yoksa, reaksiyon tamamlanır. Çözeltinin pH'ı yaklaşık dörde ulaşana kadar, tek molar oksalik asit damlacıklarını yavaş yavaş ekleyerek reaksiyon karışımını söndürün. Şimdi, iki litre susuz, peroksitiçermeyen dietil eter ile söndürülen tampon çözeltisini ayıklayın.
Katmanları sallamak ve ayırmak için ayırıcı bir huni kullanın ve eterbir Erlenmeyer şişesiiçine toplamak. İki kez daha tekrarlayın ve eter kurutmak için yaklaşık 50 gram susuz magnezyum sülfat ekleyin. Vakum filtresi hunisi üzerine, magnezyum sülfat filtrelemek için kurutulmuş eter dökün ve filtrelenmiş eter tabakasını döner evaporatörden yuvarlak bir alt şişeye aktarın.
Dönüş hızını orta hıza ayarlayın ve ham EDP kalıntısı elde etmek için sıvıyı yoğunlaşmış olmak için vakumu başlatın. Otomatik flaş arıtma makinesi kullanarak flaş sütun kromatografisi gerçekleştirmek için kalıntıyı 40 gramlık bir silika kartuşu içine yükleyin. Heksanlarda %10 etil asetatla başlayın ve 22 dakika boyunca heksanlarda %60'a kadar etil asetat yapın.
Kesirler otomatik olarak tüpler de toplanır. Daha sonra, bir yuvarlak alt şişe içine her tepeden kesirleri birleştirmek, döner buharlaştırıcı koymak ve buharlaşma başlar. Üç fraksiyonları elde edilir, DHA, EDP izomerleri, ve diepoxide.
Epoksit elde 0.151 gram esterify için, yuvarlak bir alt şişe veya küçük şişe, iki mililitre susuz metanol ve susuz toluen üç mililitre ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ekleyin. Bir kauçuk septum ve bir iğne ile argon dolu bir balon ile şişe bağlayın ve karıştırırken bir şırınga ile iki molar TMS-diazomethane 0.26 mililitre ekleyin. 10 dakika bekleyin ve soluk sarı bir renk görünene kadar 05 mililitre TMS-diazometan ekleyin.
30 dakika sonra, karışımı döner evaporatör kullanarak dikkatlice konsantre edin ve kalıntıyı arındırmak için flaş kromatografi makinesinde 40 gramlık silika jel kolon kartuşu kullanın. 22 dakika boyunca heksanlarda %4 etil asetat izokratik konsantrasyonu ile elute. Saflaştırılmış 19S içeren kesirleri toplamak, 20R-EDP metil ester ilk eluates, 16S, 17R-EDP metil ester takip.
Şimdi, kesirleri sekize bir heksandan etil-asetat karışımında ince tabaka kromatografi ile değerlendirin. Her iki izomeri içeren karışık fraksiyonları kontrol etmek için potasyum permanganat ile leke. Bir döner evaporatör üzerinde her tepeye karşılık gelen kesirler konsantre ve daha sonra elde edp esterleri miktarını belirlemek için bir denge tartmak.
Karışık kesirler kalırsa, bunları daha önce kullanılan çözücü sistemle yeniden kromatograf. Bir döner evaporatör üzerinde bireysel regioisomer içeren her fraksiyonu konsantre. Tek tek EDP metil ester regioisomerleri asit formlarına dönüştürmek için, EDP esterini küçük bir şişede 0,1 milimol başına yaklaşık 0,7 mililitre THF ile seyreltin ve 0,175 mililitre su.
Bir buz banyosunda şişeyi sıfır dereceye kadar soğutun, lityum hidroksit çözeltisinin üç eşdeğerini ekleyin ve oda sıcaklığına ısınırken bir gecede argon altında bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın. Sabah, karışımın pH üç ila dört ulaşana kadar, yavaş yavaş formik asit ekleyerek reaksiyon söndürmek. Sonra, su ve katmanları ayırmak için etil asetat iki mililitre ekleyin.
10 mililitre etil asetat ile su tabakasını üç kez ayıklayın, 20 mililitre doymuş salamura çözeltisi ile yıkayın ve etil asetat tabakasını kurutmak için çözeltiye birkaç gram susuz sodyum sülfat ekleyin. Etil asetat çözeltisini döner evaporatör kullanarak yoğunlaştırın, 10 mililitre heksan ekleyin ve tekrar konsantre olun. Azeotropically formik asit kalıntı kaldırmak için iki kez tekrarlayın.
15 dakika içinde % 10-30 etil asetat ile eluting, flaş sütun kromatografisi ile kalıntı arındırın. Döner evaporatör istenilen kesirleri konsantre ve saflaştırılmış asit göze vacuo kuru. Ham karışımın enzimatik epoksidasyondan arındırılması ndan elde edilen flaş sütun kromatogramı burada gösterilmiştir.
Üç büyük zirveleri elde edildi, sırayla eluting, ilk, tepkisiz DHA, ikinci, EDP izomerleri karışımı, ve, üçüncü, diepoxide, normal aşırı oksidasyon ürünleri olan. Rejiyoizomerlerin esterleşmesi ve ayrılmasından sonra proton NMR spektrumları yüksek saflıkta 16S, 17R-EDP ve 19S, 20R-EDP metil esterleri elde edildiğini göstermektedir. Chiral HPLC, EDP'lerin asit formlarının enantiomerik saflığını doğruladı.
Kontaminasyonu önlemek için et suyunuzu steril tuttuğunızdan ve aşılama yaparken emin olun. Epoksidasyon diğer yağ asitleri için kullanılabilir. Biz de araşidonik ve eikosapentaenoik asitler le denedik ve bu enantiopure epoksitlerin iyi verimleri elde ettik, yani 14, 15-EET ve 17, 18-EEQ.
Yani araştırmacıların epoksi yağ asitlerine erişmelerine izin veren bir protokol bu bileşiklerin biyolojik işlevleri üzerinde araştırmalara yardımcı olabilir, bu da ilaç yol açarken onların kullanımına yol açabilir. Tehlikeli kimyasallar temas ve teneffüs ile çok toksik olan Temas ve TMS-diazomethane, tehlikeli PMSF vardır. Yani ikincisi bir duman başlık ve uygun kişisel koruyucu ekipman ile kullanılmalıdır.
