Synthèse enzymatique des métabolites époxidisés de Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, et Arachidonic Acids

Ainsi, notre protocole nous permet de préparer des acides gras époxy enantiopure, et cette méthode pourrait aider à faire avancer la recherche sur les mécanismes par lesquels ces métabolites agissent dans le corps. Historiquement, les acides gras époxy purs sont très difficiles à obtenir. Donc, notre protocole est simple, rapide, rentable, et il nous permet de préparer des quantités importantes de ces métabolites.

Oui, nous avons développé un protocole pour le DHA, mais il fonctionne aussi très bien pour l’EPA et l’acide arachidonique. Travaillez rapidement, car certains des reagents sont sensibles à l’air, en particulier DHA et NADPH, et assurez-vous de tout jumeler à l’avance afin que la configuration soit simple. En outre, soyez conscient des dangers.

Notre protocole utilise des techniques en enzymologie et en chimie organique. La visualisation est essentielle pour aider les lecteurs et les téléspectateurs qui ne sont pas familiers avec les techniques spécialisées dans ces domaines. Pour inoculer, utilisez une boucle stérile ou une pipette trempée dans du stock de glycérol de PBS-BM3 transfecté DH5-alpha E.coli en cinq millilitres de bouillon stérile LB complété par 0,5 milligramme d’ampicilline.

Incuber la culture cellulaire dans un shaker à 37 degrés Celsius pendant 24 heures à 200 tours. Ensuite, ajoutez la culture de démarrage de cinq millilitres et 100 milligrammes d’ampicilline à un litre de bouillon LB stérile dans un flacon Erlenmeyer. Agiter à 37 degrés Celsius pendant six heures à 200 rpm, puis à 30 degrés Celsius pendant 18 heures à 200 rpm.

Après cela, recueillir la culture cellulaire dans des tubes de centrifugeuse, et centrifuger la culture cellulaire à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 1000 fois g. Verser le surnatant dans un autre flacon. Décontaminer avec de l’eau de Javel ou en utilisant l’autoclave, et stocker la pastille cellulaire à moins 78 degrés Celsius jusqu’à la purification enzymatique.

Pour effectuer la lyse cellulaire, décongelez d’abord la pastille cellulaire sur la glace, et résuspendez dans 40 millilitres de tampon de solubilisation glacée contenant tris, PMSF, et EDTA. Sur la glace, sonifier les cellules pendant une minute avec un homogénéiseur ultrasonique, avec un réglage de puissance de sortie de 10 et le devoir de 100, suivie d’une pause d’une minute sur la glace afin de lyse les cellules. Répétez cette procédure six fois.

Centrifugeuse la cellule lysate à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à 11.000 fois g pour pelleter les débris cellulaires. Pour effectuer la chromatographie d’affinité, dans une pièce froide ou un réfrigérateur avec une porte coulissante, à quatre degrés Celsius, préparez d’abord une forte colonne de chromatographie d’échange d’anion en lavant la résine avec cinq volumes de colonne de tampon A de Tris de 10 millimolar au pH 7.8. Ensuite, ajoutez le supernatant des lysates cellulaires à la colonne équilibrée, et lavez la colonne avec trois volumes de colonne de tampon froid A.Then, évaluez le BM3 en lavant la colonne avec six volumes de colonne de tampon froid B de Tris de 10 millimolaires et de chlorure de sodium de 600 millimolaires.

Recueillir la fraction élitente brun-rougeâtre. Si la protéine n’est pas utilisée immédiatement, mélangez-la avec un volume égal de glycérol et clignotez avec de l’azote liquide. Conservez la solution congelée à moins 78 degrés Celsius.

Pour effectuer l’epoxidation du DHA, déterminez d’abord la concentration de l’enzyme BM3 décongelée, selon la méthode d’analyse spectrale de dithionite de monoxyde de carbone. Puis, dans un bécher contenant deux litres de tampon de réaction agités sur une plaque magnétique, ajouter 0,94 millimoles de DHA diluées en 18,8 millilitres de DMSO et l’enzyme BM3 diluée à 20 nanomolaires. Pendant que la solution est en remuant, commencez la réaction d’epoxidation en ajoutant 8.7 millilitres de tampon de réaction contenant 0.94 millimoles de NADPH.

Remuer la réaction pendant 30 minutes tout en bouillonnant l’air dans le mélange de réaction avec un ballon rempli d’air attaché à une seringue et une aiguille scotchée à l’intérieur du bécher. Après cela, dessinez un microlitre du mélange de réaction, et mettez-le dans un spectrophotomètre NanoDrop pour mesurer l’absorption à 340 nanomètres. Utilisez l’eau comme blanc.

S’il n’y a pas d’absorption restante, ce qui indique que la NADPH a été consommée, la réaction est complète. Étanchez le mélange de réaction en ajoutant lentement de l’acide oxalique uni molaire dans le sens de la goutte, jusqu’à ce que le pH de la solution atteigne environ quatre. Maintenant, extrayez la solution tampon trempée avec deux litres d’éther de déthyle anhydre et sans peroxyde.

Utilisez un entonnoir séparateur pour secouer et séparer les couches, et recueillir l’éther dans un flacon Erlenmeyer. Répéter deux fois de plus et ajouter environ 50 grammes de sulfate de magnésium anhydre pour sécher l’éther. Sur un entonnoir de filtre à vide, verser l’éther séché pour filtrer le sulfate de magnésium et transférer la couche d’éther filtrée dans un flacon à fond rond de l’évaporateur rotatif.

Réglez la vitesse de rotation à moyen, et commencez le vide pour concentrer le liquide pour produire des résidus bruts d’EDP. Chargez les résidus dans une cartouche de silice de 40 grammes pour effectuer une chromatographie à colonne flash à l’aide d’une machine automatisée de purification flash. Commencez à 10% d’acétate d’éthylique dans les hexanes, et rampez jusqu’à 60% d’acétate d’éthylique dans les hexanes plus de 22 minutes.

Les fractions sont automatiquement collectées dans des tubes. Ensuite, combinez les fractions de chaque pic dans un flacon à fond rond, mettez l’évaporateur rotatif et commencez l’évaporation. Trois fractions sont obtenues, DHA, isomers EDP, et diepoxide.

Pour estérifier les 0,151 grammes d’epoxide obtenus, dans un flacon à fond rond ou un petit flacon, ajouter deux millilitres de méthanol anhydre et trois millilitres de toluène anhydre, et ajouter une barre d’agitation. Connectez le flacon avec un ballon rempli d’argon à travers un septum en caoutchouc et une aiguille, et ajoutez 0,26 millilitres de tms-diazomethane à deux molaires à travers une seringue en remuant. Attendez 10 minutes et ajoutez 05 millilitres supplémentaires de TMS-diazomethane jusqu’à ce qu’une couleur jaune pâle apparaisse.

Après 30 minutes, concentrer soigneusement le mélange à l’aide de l’évaporateur rotatif et utiliser une cartouche de colonne de gel de silice de 40 grammes sur la machine à chromatographie flash pour purifier les résidus. Elute avec une concentration isocratique de 4% d’acétate d’éthyle dans les hexanes plus de 22 minutes. Recueillir les fractions contenant le purifié 19S, 20R-EDP ester méthyle élit d’abord, suivie par 16S, 17R-EDP ester méthyle.

Maintenant, évaluez les fractions par chromatographie de couche mince dans un mélange de huit à un hexane-à-éthyl-acétate. Tache avec du permanganate de potassium pour vérifier toutes les fractions mélangées contenant les deux isomères. Concentrez les fractions correspondant à chaque pic sur un évaporateur rotatif, puis pesez sur un équilibre pour déterminer la quantité d’esters EDP obtenus.

S’il reste des fractions mélangées, re chromatographiez-les avec le même système de solvants qu’auparavant. Concentrez chaque fraction contenant le regioisomer individuel sur un évaporateur rotatif. Pour convertir les regioisomers méthyles EDP individuels en leurs formes acides, diluer l’ester EDP dans un petit flacon d’environ 0,7 millilitres de THF par 0,1 millimoles d’ester, ainsi que 0,175 millilitres d’eau.

Refroidir le flacon à zéro degré Celsius dans un bain de glace, ajouter trois équivalents de solution hydroxyde de lithium, et remuer sur une plaque de remue-pièce sous argon pendant la nuit tout en se réchauffant à température ambiante. Le matin, étanchez la réaction en ajoutant lentement de l’acide formique, jusqu’à ce que le pH du mélange atteigne trois à quatre. Ajouter ensuite de l’eau et deux millilitres d’acétate d’éthyle pour séparer les couches.

Extraire la couche d’eau avec 10 millilitres d’acétate d’éthyle trois fois, laver avec 20 millilitres de solution de saumure saturée, et ajouter plusieurs grammes de sulfate de sodium anhydre dans la solution pour sécher la couche d’acétate d’éthyle. Concentrez la solution d’acétate d’éthylique à l’aide de l’évaporateur rotatif, ajoutez 10 millilitres d’hexanes et concentrez-vous à nouveau. Répétez deux fois pour éliminer azeotropically acide formique résiduel.

Purifier les résidus par chromatographie à colonne flash, en l’évasant de 10 à 30% d’acétate d’éthyle pendant 15 minutes. Concentrez les fractions désirées dans l’évaporateur rotatif et séchez-les en vacuo pour vous permettre l’acide purifié. Le chromatogramme de colonne flash obtenu lors de la purification du mélange brut de l’epoxidation enzymatique est montré ici.

Trois pics majeurs ont été obtenus, s’échappant de l’ordre, d’une première, d’un DHA non réagi, deuxièmement, d’un mélange d’isomères EDP et, troisièmement, de diepoxide, qui sont des produits normaux de suroxydation. Après l’estérification et la séparation des regioisomers, les spectres de NMR de proton indiquent que des esters méthyles de haute pureté 16S, 17R-EDP et 19S, 20R-EDP méthyle ont été obtenus. Chiral HPLC a confirmé la pureté enantiomeric des formes acides des EDP.

Assurez-vous de garder votre bouillon stérile pendant la manipulation et l’inoculation pour éviter la contamination. L’epoxidation peut être utilisée pour d’autres acides gras. Nous l’avons donc aussi essayé avec des acides arachidoniques et eicosapentaénoïques, et nous avons obtenu de bons rendements de ces epoxides enantiopure, donc 14, 15-EET et 17, 18-EEQ.

Ainsi, un protocole qui permet aux chercheurs d’accéder aux acides gras époxy pourrait aider à la recherche sur les fonctions biologiques de ces composés, ce qui pourrait conduire à leur utilisation comme médicaments conduit. Les produits chimiques dangereux sont le PMSF, qui est dangereux par contact, et le TMS-diazomethane, qui est très toxique par contact et inhalation. Ainsi, ce dernier doit être utilisé dans un capot de fumée et avec un équipement de protection individuelle approprié.