Así que nuestro protocolo nos permite preparar ácidos grasos epoxi enantiopure, y este método podría ayudar a avanzar en la investigación sobre los mecanismos por los cuales estos metabolitos actúan en el cuerpo. Históricamente, los ácidos grasos epoxi puros son muy difíciles de obtener. Así que nuestro protocolo es simple, rápido, rentable, y nos permite preparar cantidades significativas de estos metabolitos.
Sí, desarrollamos un protocolo para DHA, pero también funciona muy bien para EPA y ácido araquidónico. Trabaje rápidamente, ya que algunos de los reactivos son sensibles al aire, específicamente DHA y NADPH, y asegúrese de emparejar todo con antelación para que la configuración sea simple. Además, tenga en cuenta los peligros.
Nuestro protocolo utiliza técnicas tanto en enzimología como en química orgánica. La visualización es fundamental para ayudar a los lectores y espectadores que no están familiarizados con las técnicas especializadas en estos campos. Para inocular, utilice un bucle estéril o pipeta sumergido en stock de glicerol de pBS-BM3 trans infectado DH5-alfa E.coli en cinco mililitros de caldo LB estéril complementado con 0,5 miligramos de ampicilina.
Incubar el cultivo celular en una coctelera a 37 grados centígrados durante 24 horas a 200 rpm. A continuación, agregue el cultivo de arranque de cinco mililitros y 100 miligramos de ampicilina a un litro de caldo LB estéril en un matraz De Erlenmeyer. Agitar a 37 grados Celsius durante seis horas a 200 rpm, luego a 30 grados Celsius durante 18 horas a 200 rpm.
Después de eso, recoger el cultivo celular en tubos centrífugos, y centrifugar el cultivo celular a cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 1.000 veces g. Vierta el sobrenadante en otro matraz. Descontamine con lejía o utilizando el autoclave, y almacene el pellet celular en menos 78 grados Celsius hasta la purificación enzimática.
Para realizar la lelisis celular, primero descongele el pellet celular sobre hielo y resuspend en 40 mililitros de tampón de solubilización helada que contenga Tris, PMSF y EDTA. Mientras que en el hielo, sonicar las células durante un minuto con un homogeneizador ultrasónico, con un ajuste de potencia de salida de 10 y el deber de 100, seguido de una rotura de un minuto en el hielo con el fin de ensanizar las células. Repita este procedimiento seis veces.
Centrifugar el llario de la célula a cuatro grados Celsius durante 30 minutos a 11.000 g para peletizar los desechos celulares. Para realizar cromatografía de afinidad, en una sala fría o frigorífico con una puerta corredera, a cuatro grados centígrados, primero prepare una fuerte columna de cromatografía de intercambio de aniones lavando la resina con cinco volúmenes de columna de tampón A de Tris de 10 milímetros a pH 7.8. A continuación, agregue el sobrenadante de las lysates de celda a la columna equilibrada, y lave la columna con tres volúmenes de columna de tampón en frío A.Then, elula el BM3 lavando la columna con seis volúmenes de columna de tampón frío B de Tris de 10 mililitrolares y cloruro de sodio de 600 mililitros.
Recoger la fracción eluyente de color marrón rojizo. Si la proteína no se está utilizando inmediatamente, mezcle con un volumen igual de glicerol y congele con nitrógeno líquido. Almacene la solución congelada a menos 78 grados centígrados.
Para realizar la epoxidación de DHA, primero determine la concentración de la enzima BM3 descongelada, de acuerdo con el método de ensayo espectral de ditionita de monóxido de carbono. Luego, en un vaso de precipitados que contenga dos litros de tampón de reacción agitado en una placa de agitación magnética, agregue 0,94 milimolos de DHA diluidos en 18,8 mililitros de DMSO y la enzima BM3 diluida a 20 nanomolares. Mientras la solución está agitando, comience la reacción de epoxidación añadiendo 8,7 mililitros de tampón de reacción que contiene 0,94 milimolemos de NADPH.
Revuelva la reacción durante 30 minutos mientras burbujea el aire en la mezcla de reacción con un globo lleno de aire unido a una jeringa y una aguja pegada al interior del vaso de precipitados. Después de eso, elaborar un microlitro de la mezcla de reacción, y ponerlo en un espectrofotómetro NanoDrop para medir la absorbancia a 340 nanómetros. Use agua como blanco.
Si no queda la absorbancia, lo que indica que se ha consumido NADPH, la reacción se ha completado. Aprieta la mezcla de reacción añadiendo lentamente un ácido oxálico molar por gotas, hasta que el pH de la solución alcance aproximadamente cuatro. Ahora, extraiga la solución tampón refrigerada con dos litros de éter de dietil anhidro, libre de peróxido.
Utilice un embudo separador para agitar y separar las capas, y recoja el éter en un matraz Erlenmeyer. Repita dos veces adicionales y agregue aproximadamente 50 gramos de sulfato de magnesio anhidro para secar el éter. En un embudo de filtro de vacío, vierta el éter seco para filtrar el sulfato de magnesio y transfiera la capa de éter filtrada a un matraz de fondo redondo del evaporador rotatorio.
Ajuste la velocidad de rotación a medio e inicie el vacío para concentrar el líquido para producir residuos de EDP crudo. Cargue el residuo en un cartucho de sílice de 40 gramos para realizar la cromatografía de columnas flash utilizando una máquina de purificación flash automatizada. Comience en 10%acetato de etilo en hexanos, y rampa hasta 60%acetato de etilo en hexanos durante 22 minutos.
Las fracciones se recogen automáticamente en tubos. A continuación, combine las fracciones de cada pico en un matraz de fondo redondo, coloque el evaporador rotatorio e inicie la evaporación. Se obtienen tres fracciones, isómeros DHA, EDP y diepoxido.
Para esterificar los 0,151 gramos de epóxido obtenidos, en un matraz de fondo redondo o un frasco pequeño, añadir dos mililitros de metanol anhidro y tres mililitros de tolueno anhidro, y añadir una barra de agitación. Conecte el matraz con un globo lleno de argón a través de un tabique de goma y una aguja, y agregue 0,26 mililitros de TMS-diazomethane de dos molares a través de una jeringa mientras se agita. Espere 10 minutos y agregue 05 mililitros adicionales de TMS-diazomethane hasta que aparezca un color amarillo pálido.
Después de 30 minutos, concentre cuidadosamente la mezcla con el evaporador rotatorio y utilice un cartucho de columna de gel de sílice de 40 gramos en la máquina de cromatografía flash para purificar el residuo. Eluir con una concentración isocrática de 4%acetato de etilo en hexanos durante 22 minutos. Recoger las fracciones que contienen el éster metílico purificado 19S, 20R-EDP elue primero, seguido de 16S, 17R-EDP éster metílico.
Ahora, evalúe las fracciones por cromatografía de capa delgada en una mezcla de ocho a uno de hexano a etilo-acetato. Mancha con permanganato de potasio para comprobar si hay fracciones mixtas que contengan ambos isómeros. Concentrar las fracciones correspondientes a cada pico en un evaporador rotatorio, y luego pesar en un equilibrio para determinar la cantidad de ésteres EDP obtenidos.
Si quedan fracciones mixtas, vuelva a cromatografía con el mismo sistema de disolventes que se utilizó anteriormente. Concentrar cada fracción que contenga el regioisomer individual en un evaporador rotatorio. Para convertir regioisomers individuales de éster metilo EDP en sus formas ácidas, diluir el éster EDP en un vial pequeño con aproximadamente 0,7 mililitros de THF por 0,1 milimoles de éster, junto con 0,175 mililitros de agua.
Enfríe el vial a cero grados centígrados en un baño de hielo, agregue tres equivalentes de solución de hidróxido de litio y revuelva una placa de agitación bajo argón durante la noche mientras se calienta a temperatura ambiente. Por la mañana, apagar la reacción añadiendo lentamente ácido fórmico, hasta que el pH de la mezcla alcance de tres a cuatro. Luego, agregue agua y dos mililitros de acetato de etilo para separar las capas.
Extraer la capa de agua con 10 mililitros de acetato de etilo tres veces, lavar con 20 mililitros de solución de salmuera saturada, y añadir varios gramos de sulfato sódico anhidro en la solución para secar la capa de acetato de etilo. Concentrar la solución de acetato de etilo utilizando el evaporador rotatorio, añadir 10 mililitros de hexanos y concentrarse de nuevo. Repita dos veces para eliminar azeotrópicamente el ácido fórmico residual.
Purificar el residuo mediante cromatografía de columna flash, eluiendo con 10 a 30%acetato de etilo durante 15 minutos. Concentrar las fracciones deseadas en el evaporador rotatorio, y secar en vacuo para permitir el ácido purificado. El cromatograma de columna flash obtenido tras la purificación de la mezcla bruta a partir de la epoxidación enzimática se muestra aquí.
Se obtuvieron tres picos principales, elundo en el orden de, en primer lugar, DHA no reaccionado, segundo, mezcla de isómeros EDP, y, en tercer lugar, diepoxido, que son productos normales de sobreoxidación. Después de la esterificación y separación de los regioisomers, los espectros de RMN de protones indican que se obtuvieron ésteres metílicos de alta pureza 16S, 17R-EDP y 19S, 20R-EDP. La HPLC quiral confirmó la pureza enantiomérica de las formas ácidas de los EDP.
Asegúrese de mantener su caldo estéril mientras manipula e inocula para evitar la contaminación. La epoxidación se puede utilizar para otros ácidos grasos. Así que también lo probamos con ácidos araquidónicos y eicosapentaenoicos, y obtuvimos buenos rendimientos de esos epóxidos de enantiopure, por lo que 14, 15-EET y 17, 18-EEQ.
Por lo tanto, un protocolo que permite a los investigadores acceder a los ácidos grasos epoxi podría ayudar en la investigación sobre las funciones biológicas de estos compuestos, que podría conducir a su uso como conductores de drogas. Los productos químicos peligrosos son PMSF, que es peligroso por contacto, y TMS-diazomethane, que es muy tóxico por contacto e inhalación. Por lo tanto, este último debe utilizarse en una campana de humo y con el equipo de protección personal adecuado.
