So ermöglicht unser Protokoll uns, enantiopure Epoxid-Fettsäuren vorzubereiten, und diese Methode könnte helfen, die Forschung über die Mechanismen, mit denen diese Metaboliten im Körper wirken, voranzutreiben. Historisch gesehen sind reine Epoxidfettsäuren sehr schwer zu erhalten. Unser Protokoll ist also einfach, schnell und kostengünstig und ermöglicht es uns, erhebliche Mengen dieser Metaboliten vorzubereiten.
Ja, wir haben ein Protokoll für DHA entwickelt, aber es funktioniert auch sehr gut für EPA und Arachidonsäure. Arbeiten Sie schnell, da einige der Reagenzien luftempfindlich sind, speziell DHA und NADPH, und achten Sie darauf, alles im Voraus zu koppeln, so dass die Einrichtung einfach ist. Seien Sie sich auch der Gefahren bewusst.
Unser Protokoll verwendet Techniken sowohl in der Enzymologie als auch in der organischen Chemie. Die Visualisierung ist wichtig, um Lesern und Betrachtern zu helfen, die mit den spezialisierten Techniken in diesen Bereichen nicht vertraut sind. Um zu impfen, verwenden Sie eine sterile Schleife oder Pipette in Glycerin-Bestand von pBS-BM3 transfiziert DH5-alpha E.coli in fünf Milliliter sterile LB-Brühe mit 0,5 Milligramm Ampicillin ergänzt.
Die Zellkultur in einem Shaker bei 37 Grad Celsius 24 Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute bebrüten. Dann fügen Sie die Fünf-Milliliter-Starterkultur und 100 Milligramm Ampicillin zu einem Liter steriler LB-Brühe in einem Erlenmeyerkolben hinzu. Schütteln Sie bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden bei 200 Rpm, dann bei 30 Grad Celsius für 18 Stunden bei 200 Rpm.
Danach die Zellkultur in Zentrifugenröhren sammeln und die Zellkultur bei vier Grad Celsius 10 Minuten bei 1000 mal g zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand in einen anderen Kolben. Dekontaminieren Sie mit Bleichmittel oder mit dem Autoklaven, und speichern Sie das Zellpellet bei minus 78 Grad Celsius bis zur Enzymreinigung.
Um die Zelllyse durchzuführen, tauen Sie zuerst das Zellpellet auf Eis auf und setzen Sie in 40 Millilitere eiskalte Löslichkeitspuffer mit Tris, PMSF und EDTA wieder auf. Während sie auf dem Eis sind, beschallen Sie die Zellen für eine Minute mit einem Ultraschall-Homogenisator, mit einer Ausgangsleistungseinstellung von 10 und einer Leistung von 100, gefolgt von einer einminütigen Pause auf Eis, um die Zellen zu lysieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang sechsmal.
Zentrifuge die Zelle lysiert bei vier Grad Celsius für 30 Minuten bei 11.000 mal g, um den Zellabfall zu pellet. Um die Affinitätschromatographie in einem Kühlraum oder Kühlschrank mit Schiebetür bei vier Grad Celsius durchzuführen, bereiten Sie zunächst eine starke Anionenaustauschchromatographiesäule vor, indem Sie das Harz mit fünf Säulenvolumen des Puffers A von 10-Millimolar Tris bei pH 7,8 waschen. Als nächstes fügen Sie den Überstand der Zelllysate in die ausgeglichene Spalte ein und waschen Sie die Säule mit drei Spaltenvolumina des Kaltpuffers A. Dann, elute die BM3 durch Waschen der Spalte mit sechs Spaltenvolumen kaltpuffer B von 10-Millimolar Tris und 600-Millimolar Natriumchlorid.
Sammeln Sie die rötlich-braune Eluentenfraktion. Wenn das Protein nicht sofort verwendet wird, mischen Sie es mit einem gleichen Volumen von Glycerin, und Flash-Freeze mit flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die gefrorene Lösung bei minus 78 Grad Celsius auf.
Um die Epoxidation von DHA durchzuführen, bestimmen Sie zunächst die Konzentration des aufgetauten BM3-Enzyms gemäß der Carbonmonoxid-Dithionit-Spektral-Assay-Methode. Dann, in einem Becher, der zwei Liter Reaktionspuffer enthält, der auf einer magnetischen Rührplatte gerührt wird, fügen Sie 0,94 Millimol DHA in 18,8 Milliliter DMSO verdünnt und das BM3-Enzym auf 20 Nanomolar verdünnt. Während die Lösung rührt, beginnen Sie die Epoxidationsreaktion, indem Sie 8,7 Milliliter Reaktionspuffer hinzufügen, der 0,94 Millimole NADPH enthält.
Rühren Sie die Reaktion für 30 Minuten, während Luft in die Reaktionsmischung mit einem luftgefüllten Ballon an einer Spritze befestigt und Nadel an der Innenseite des Bechers geklebt. Danach einen Mikroliter des Reaktionsgemisches aufstellen und in ein NanoDrop Spektralphotometer geben, um die Absorption bei 340 Nanometern zu messen. Verwenden Sie Wasser als Rohling.
Wenn keine Restabsorption vorhanden ist, was darauf hinweist, dass NADPH verbraucht wurde, ist die Reaktion vollständig. Das Reaktionsgemisch durch langsames Hinzufügen von einmollaren Oxalsäure tropfenweise ablöschen, bis der pH-Wert der Lösung etwa vier erreicht. Extrahieren Sie nun die abgeschreckte Pufferlösung mit zwei Litern wasserfreiem, peroxidfreiem Diethylether.
Verwenden Sie einen Trenntrichter, um die Schichten zu schütteln und zu trennen, und sammeln Sie den Äther in einem Erlenmeyerkolben. Wiederholen Sie zwei weitere Male, und fügen Sie etwa 50 Gramm wasserfreies Magnesiumsulfat hinzu, um den Äther zu trocknen. Auf einem Vakuumfiltertrichter den getrockneten Äther gießen, um das Magnesiumsulfat zu filtern, und die gefilterte Ätherschicht in einen rund-Boden-Kolben des Rotationsverdampfers geben.
Stellen Sie die Rotationsgeschwindigkeit auf Medium ein, und starten Sie das Vakuum, um die Flüssigkeit zu konzentrieren, um rohe EDP-Rückstände zu erzielen. Laden Sie den Rückstand in eine 40-Gramm-Kieselsäurepatrone, um die Flash-Säulenchromatographie mit einer automatischen Blitzreinigungsmaschine durchzuführen. Beginnen Sie bei 10%ethylacetat in Hexanen und hochfahren bis zu 60%ethylacetat in Hexanen über 22 Minuten.
Die Fraktionen werden automatisch in Rohren gesammelt. Kombinieren Sie dann die Fraktionen von jedem Gipfel zu einem rund-Boden-Kolben, setzen Sie den Rotationsverdampfer auf und starten Sie die Verdunstung. Es werden drei Fraktionen erhalten, DHA, EDP-Isomere und Diepoxid.
Um die erhaltenen 0,151 Gramm Epoxid in einem rund-Boden-Kolben oder einer kleinen Durchstechflasche zu verestern, fügen Sie zwei Milliliter wasserfreies Methanol und drei Milliliter wasserfreies Toluol hinzu, und fügen Sie einen Rührbalken hinzu. Verbinden Sie den Kolben mit einem mit Argon gefüllten Ballon durch ein Gummiseptum und eine Nadel, und fügen Sie 0,26 Milliliter zweimollaren TMS-Diazomememe durch eine Spritze unter Rühren hinzu. Warten Sie 10 Minuten, und fügen Sie weitere 05 Milliliter TMS-Diazomethan hinzu, bis eine blassgelbe Farbe erscheint.
Nach 30 Minuten die Mischung sorgfältig mit dem Rotationsverdampfer konzentrieren und eine 40-Gramm-Kieselgel-Säulenpatrone auf der Blitzchromatographie-Maschine verwenden, um den Rückstand zu reinigen. Elute mit einer isokratischen Konzentration von 4%Ethylacetat in Hexanen über 22 Minuten. Sammeln Sie zuerst die Fraktionen, die die gereinigten 19S, 20R-EDP Methylestereluate enthalten, gefolgt von 16S, 17R-EDP Methylester.
Bewerten Sie nun die Fraktionen durch dünnschichtige Chromatographie in einem Hexan-Ethylacetat-Gemisch von acht zu eins. Stain mit Kaliumpermanganat, um nach gemischten Fraktionen zu suchen, die beide Isomere enthalten. Konzentrieren Sie die Fraktionen, die jedem Peak entsprechen, auf einen Rotationsverdampfer und wiegen Sie dann auf einem Gleichgewicht, um die Menge der erhaltenen EDP-Ester zu bestimmen.
Wenn gemischte Fraktionen übrig bleiben, rechromatographieren Sie sie mit dem gleichen Lösungsmittelsystem wie bisher verwendet. Konzentrieren Sie jede Fraktion, die das einzelne Regioisomer enthält, auf einen Rotationsverdampfer. Um einzelne EDV-Methylester-Regioisomen in ihre Säureformen umzuwandeln, verdünnen Sie den EDV-Ester in einer kleinen Durchstechflasche mit etwa 0,7 Milliliter THF pro 0,1 Millimol Ester, zusammen mit 0,175 Milliliter Wasser.
Kühlen Sie die Durchstechflasche in einem Eisbad auf null Grad Celsius, fügen Sie drei Äquivalente von Lithiumhydroxid-Lösung hinzu und rühren Sie auf einer Rührplatte unter Argon über Nacht, während sie sich auf Raumtemperatur erwärmt. Am Morgen die Reaktion durch langsames Hinzufügen von Ameisensäure abschrecken, bis der pH-Wert der Mischung drei bis vier erreicht. Dann wasser und zwei Milliliter Ethylacetat hinzufügen, um die Schichten zu trennen.
Die Wasserschicht dreimal mit 10 MilliliterEthylacetat abziehen, mit 20 Millilitern gesättigter Solelösung waschen und mehrere Gramm wasserfreies Natriumsulfat in die Lösung zum Trocknen der Ethylacetatschicht geben. Konzentrieren Sie die Ethylacetatlösung mit dem Rotationsverdampfer, fügen Sie 10 Milliliter Hexane hinzu und konzentrieren Sie sich erneut. Zweimal wiederholen, um azeotropisch Restameisensäure zu entfernen.
Reinigen Sie den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie, Elumitieren mit 10 bis 30%Ethylacetat über 15 Minuten. Konzentrieren Sie die gewünschten Fraktionen im Rotationsverdampfer und trocknen Sie im Vakuum, um sich die gereinigte Säure zu leisten. Das Beikochromatogramm der Blitzsäule, das bei der Reinigung des Rohgemisches aus enzymatischer Epoxidation gewonnen wird, wird hier gezeigt.
Es wurden drei haupthebespitzen erreicht, die in der Reihenfolge der erstens unreagierten DHA, der zweiten Mischung von EDV-Isomen und drittens Derpoxid, die normale Überoxidationsprodukte sind, elutierend. Nach veresterter und abgetrennter Regioisomer deuten die Proton-NMR-Spektren darauf hin, dass hochreine 16S, 17R-EDP und 19S, 20R-EDP-Methylester erhalten wurden. Chiral HPLC bestätigte enantiomere Reinheit der sauren Formen der EDP.
Achten Sie darauf, Ihre Brühe während der Handhabung und Impfung steril zu halten, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Epoxidation kann für andere Fettsäuren verwendet werden. Also probierten wir es auch mit arachiiden und eicosapentaennoic Säuren, und wir erhielten gute Erträge dieser enantiopure Epoxide, so 14, 15-EET und 17, 18-EEQ.
So könnte ein Protokoll, das Forschern den Zugang zu Epoxid-Fettsäuren ermöglicht, bei der Erforschung der biologischen Funktionen dieser Verbindungen helfen, was zu ihrer Verwendung als Arzneimittel-Leads führen könnte. Die gefährlichen Chemikalien sind PMSF, das durch Kontakt gefährlich ist, und TMS-Diazomeme, das durch Kontakt und Einatmen sehr giftig ist. Letzteres sollte also in einer Dunstabzugshaube und mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung verwendet werden.
