그래서 우리의 프로토콜은 우리가 enantiopure 에폭시 지방산을 준비하는 것을 허용하고, 이 방법은 이 대사 산물이 바디에서 작용하는 기계장치에 대한 연구를 진행하는 것을 도울 수 있습니다. 역사적으로 순수 에폭시 지방산을 얻기가 매우 어렵습니다. 따라서 우리의 프로토콜은 간단하고 빠르며 비용 효율적이며 이러한 대사 산물의 상당한 양을 준비할 수 있습니다.
예, 우리는 DHA에 대한 프로토콜을 개발, 하지만 그것은 또한 EPA와 아라키도니아산에 대 한 아주 잘 작동. 시약의 일부는 공기에 민감한, 특히 DHA와 NADPH이기 때문에 신속하게 작업하고 설정이 간단하도록 모든 것을 미리 페어링해야합니다. 또한, 위험을 주의하십시오.
우리의 프로토콜은 효소학과 유기 화학 모두에서 기술을 사용합니다. 시각화는 이러한 분야의 특수 기술에 익숙하지 않은 독자와 시청자를 돕기 위해 매우 중요합니다. 접종을 하려면 pBS-BM3 의 글리세롤 스톡에 담근 멸균 루프 또는 파이펫을 0.5 밀리그램의 암피실린으로 보충한 멸균 LB 국물의 5밀리리터에 담근 멸균 루프 또는 파이펫을 사용하십시오.
200 rpm에서 24 시간 동안 섭씨 37도에서 셰이커로 세포 배양을 배양하십시오. 그런 다음, 5 밀리리터 스타터 배양과 100 밀리그램의 암피실린을 Erlenmeyer 플라스크에 멸균 LB 국물에 1리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 6시간 동안 200rpm에서, 섭씨 30도에서 200rpm에서 18시간 동안 흔들어 보겠습니다.
그 후, 원심분리기 튜브로 세포 배양을 수집하고, 1, 000g에서 10분 동안 섭씨 4도에서 세포 배양을 원심분리한다. 상체를 다른 플라스크에 붓습니다. 표백제또는 오토클레이브를 사용하여 오염을 제거하고 효소가 정화될 때까지 세포 펠릿을 섭씨 영하 78도에 보관합니다.
세포 용해를 수행하기 위해 먼저 얼음에 세포 펠릿을 해동하고 Tris, PMSF 및 EDTA를 포함하는 얼음 차가운 용용화 버퍼40 밀리리터에서 다시 중단하십시오. 얼음에 있는 동안, 초음파 균질화로 1 분 동안 세포를 초음파 처리, 출력 전원 설정 10 및 100의 의무, 세포를 lyse하기 위해 얼음에 1 분 휴식. 이 절차를 여섯 번 반복합니다.
원심분리기세포는 세포 잔해를 11, 000배에서 30분 동안 섭씨 4도에서 흘린다. 친화도 크로마토그래피를 수행하기 위해, 슬라이딩 도어가있는 차가운 방이나 냉장고에서 섭씨 4도에서 먼저 pH 7.8에서 10 밀리알러 트리스의 5 개의 열 볼륨으로 수지를 세척하여 강력한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 준비합니다. 다음으로, 셀 용액의 상체를 평형 컬럼에 추가하고, 차가운 완충제 A.Then의 3개의 컬럼 부피로 컬럼을 세척하고, 10밀리머 트리스의 6개의 컬럼 부피와 600밀리알라 나트륨염화로 컬럼을 세척하여 BM3를 엘테한다.
붉은 갈색 용액 분획을 수집합니다. 단백질이 즉시 사용되지 않는 경우 동일한 양의 글리세롤과 혼합하고 액체 질소와 플래시 프리즈를 넣습니다. 냉동 용액을 영하 78도에 보관하십시오.
DHA의 편광을 수행하기 위해, 일산화탄소 디티온인테 스펙트럼 분석 방법에 따라 먼저 해동 된 BM3 효소의 농도를 결정한다. 그런 다음, 자기 교반 판에 교반되는 반응 버퍼의 두 리터를 포함하는 비커에서, DMSO의 18.8 밀리리터와 BM3 효소가 20 나노 몰라로 희석된 DHA의 0.94 밀리몰을 추가합니다. 용액이 교반하는 동안 NADPH의 0.94 밀리몰을 함유한 반응 버퍼8.7 밀리리터를 추가하여 편산화 반응을 시작합니다.
반응에 30분 동안 저어주사기에 부착된 공기가 채워진 풍선과 비커 내부에 바늘이 부착되어 반응 혼합물에 공기를 부적시세요. 그 후, 반응 혼합물의 마이크로리터 1개를 끌어서 나노드롭 분광광계에 넣어 340 나노미터에서 흡광도를 측정한다. 물을 빈 칸으로 사용하십시오.
NADPH가 소비되었음을 나타내는 남은 흡광도가 없는 경우 반응이 완료됩니다. 용액의 pH가 약 4에 도달할 때까지 1-어금다 옥살산을 드롭와이즈로 천천히 첨가하여 반응 혼합물을 담급니다. 이제 담금질 버퍼 용액을 과산화수소가 없는 디틸 에테르 2리터로 추출합니다.
분리 깔때기를 사용하여 레이어를 흔들고 분리하고 에테르를 Erlenmeyer 플라스크로 수집합니다. 두 번 더 반복하고 약 50 그램의 무수 마그네슘 황산염을 추가하여 에테르를 건조시킵니다. 진공 필터 깔때기에 말린 에테르를 부어 황산 마그네슘을 걸러내고 여과 된 에테르 층을 회전 증발기의 둥근 바닥 플라스크로 옮춥니다.
회전 속도를 중간 크기로 조정하고 진공을 시작하여 액체를 농축하여 원유 EDP 잔류물을 산출합니다. 잔류물을 40그램의 실리카 카트리지에 적재하여 자동화된 플래시 정화 기를 사용하여 플래시 컬럼 크로마토그래피를 수행합니다. 헥산에서 10%에틸 아세테이트에서 시작하여 22분 동안 헥산에서 최대 60%의 아세테이트를 장착할 수 있습니다.
분수는 자동으로 튜브에서 수집됩니다. 그런 다음 각 피크의 분획을 둥근 바닥 플라스크에 결합하고 회전 증발기에 넣고 증발을 시작합니다. 3개의 분획, DHA, EDP 이소마, 및 디옥사이드를 얻습니다.
얻은 0.151 그램의 에폭료를 원형 플라스크 또는 작은 유리병에 에스로티화하려면 무수성 메탄올 2 밀리리터와 무수 성 톨루엔 3 밀리리터를 추가하고 저어바를 추가합니다. 플라스크를 고무 중격과 바늘을 통해 아르곤으로 채워진 풍선으로 연결하고 교반하는 동안 주사기를 통해 2 개의 어금니 TMS-diazomethane0의 0.26 밀리리터를 추가하십시오. 10분간 기다린 후 TMS-diazo메탄의 05 밀리리터를 추가하여 옅은 노란색이 나타날 때까지 기다립니다.
30분 후, 회전 증발기를 사용하여 혼합물을 조심스럽게 농축하고, 플래시 크로마토그래피 기계에 40그램 실리카 젤 컬럼 카트리지를 사용하여 잔류물을 정화한다. 22분 동안 헥산에서 4%에틸 아세테이트의 동위 층 농도를 가진 엘루트. 정제된 19S, 20R-EDP 메틸 에스테르를 함유한 분획을 먼저 수집하고, 그 다음으로 16S, 17R-EDP 메틸 에스테르가 그 뒤를 이다.
지금, 8 대 1 헥산 -에틸 아세테이트 혼합물에서 얇은 층 크로마토그래피에 의해 분획을 평가합니다. 과만가네이트 칼륨을 가진 얼룩은 두 이소마를 포함하는 혼합 분획을 확인합니다. 회전 증발기에 각 피크에 해당하는 분획을 농축한 다음 균형에 무게를 두어 얻은 EDP 에스테르의 양을 결정합니다.
혼합 분획이 남아 있으면 이전에 사용했던 것과 동일한 용매 시스템으로 다시 크로마토그래프를 다시 사용합니다. 개별 혈관성자를 포함하는 각 분획을 회전 증발기에 농축합니다. 개별 EDP 메틸 에스테르 regioisomers를 그들의 산 형태로 변환하려면, 물 0.1밀리리터와 함께 에스테르의 0.1 밀리몰당 THF의 약 0.7 밀리리터와 작은 유리병에 EDP 에스테르를 희석.
유리병을 얼음 욕조에서 섭씨 0도까지 식히고, 수산화 리튬 용액 3개 상당을 추가하고, 실온으로 따뜻해지는 동안 밤새 아르곤 아래 의욕판을 저어줍니다. 아침에, 혼합물의 pH가 3 ~ 4에 도달 할 때까지 천천히 포믹 산을 추가하여 반응을 담금질. 그런 다음, 층을 분리하기 위해 물과 에틸 아세테이트의 두 밀리리터를 추가합니다.
에틸 아세테이트 10밀리리터를 3회 추출하고, 포화염수 액액 20밀리리터로 세척하고, 에틸 아세테이트 층을 건조시키기 위해 용액에 여러 그램의 무수성 나트륨 황산염을 첨가한다. 회전 증발기를 사용하여 에틸 아세테이트 솔루션을 농축하고, 육사 10밀리리터를 추가하고, 다시 농축한다. 잔류 포믹 산을 제거하기 위해 두 번 반복하십시오.
플래시 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정화하여 15분 동안 10~30%의 아세테이트로 희석합니다. 회전 증발기에 원하는 분획을 농축하고, 정제산을 감당하기 위해 바쿠오에서 건조한다. 효소 에편화로부터 조분 혼합물의 정화 시 얻은 플래시 컬럼 크로마토그램이 여기에 나와 있다.
세 가지 주요 피크를 얻어, 첫 번째, 비반응 DHA, 두 번째, EDP 이소마의 혼합물, 그리고, 세 번째, 디옥사이드의 순서로 청례, 이는 정상적인 과산화 제품입니다. 혈관성모의 에스테르화 및 분리에 이어, 양성자 NMR 스펙트럼은 고순도 16S, 17R-EDP 및 19S, 20R-EDP 메틸 에스테르를 획득했음을 나타낸다. 키랄 HPLC는 EDP의 산 형태의 내황 순도를 확인했습니다.
오염을 피하기 위해 처리 하고 접종하는 동안 국물을 멸균하십시오. 편산화는 다른 지방산에 사용될 수 있다. 그래서 우리는 또한 아라키도닉과 에이코사펜타테노산으로 시도했고, 우리는 그 enantiopure 에산화물의 좋은 수확량을 얻었기 때문에 14, 15-EET 및 17, 18-EEQ.
그래서 연구원이 에폭시 지방산에 접근할 수 있게 하는 프로토콜은 이 화합물의 생물학 기능에 대한 연구에 도움이 될 수 있습니다, 이는 약물 리드로 그들의 사용으로 이어질 수 있습니다. 유해 화학물질은 접촉에 의해 유해한 PMSF와 접촉 및 흡입에 의해 매우 독성이 있는 TMS-diazo메탄입니다. 그래서 후자는 연기 후드와 적절한 개인 보호 장비에 사용해야합니다.
