多尾根结鱼巨噬细胞的快速隔离

新出现的证据涉及背根结节巨噬细胞对神经病变疼痛发育和神经损伤背景下的斧尾修复的贡献。快速表型的后根结节巨噬细胞的反应是需要识别未知的神经免疫因素。在这里，我们演示我们的实验室如何使用无酶的机械分离协议快速有效地将巨噬细胞从后根根刚体分离。

与标准酶协议相比，该协议的耗时要小很多，而且我们经常把它用于荧光激活细胞分选分析。在开始实验之前，准备密度梯度介质的工作溶液，将九卷介质与一卷无钙和无镁的 10X HBSS 混合，并放在冰上。确认鼠标已完全麻醉后爪捏没有反应。

首先将麻醉小鼠放在化学烟罩内，用胶带固定四只爪子。使用钳子将皮肤抬到肋骨下方。然后用手术剪刀，做一个小切口，露出肝脏和隔膜。

使用相同的剪刀，切割隔膜和肋骨。然后打开胸腔，露出跳动的心脏。接下来用虹膜剪刀，快速剪右心房附属物。

一旦出血被注意到，插入一个30规格的针头到左心室的后端，并慢慢注射10毫升预冷却的1XPBS，以穿行动物。要进行后视乳切除术，请将鼠标放在易发位置。使用大小 11 手术刀，使两个纵向横向深切口从胸腔区域开始到神圣区域。

然后去除露出背部肌肉层的皮肤。然后与弗里德曼-皮尔森荣弗，剥离结缔组织和肌肉，直到隆椎过程和双边横向过程暴露。首先，使用弗里德曼-皮尔森的脊柱小心地打开后腰脊柱，然后在弗里德曼-皮尔森荣格和诺耶斯弹簧剪刀之间切换，以去除椎骨，露出脊髓与完整的脊髓神经连接。

小心解剖异质和反向腰椎 DRG。放入一毫升冰冷钙和无镁1X HBSS中，放入Dounce组织均质器中。在 Dounce 均质器中，用松散的害虫使 DRG 组织均质 20 到 25 次。

将无菌 70 微米尼龙细胞过滤器放在无菌的 50 毫升锥形管中。使用 800 微升的冰码 1X HBSS 来弄湿细胞过滤器。使用移液器将均质组织悬浮液从均质器收集到湿细胞过滤器上，并收集到 50 毫升锥形管中。

用800微升的冰1X HBSS冲洗两次均质剂，将液体收集到同一个50毫升锥形管中，以增加产量。将1.5毫升的均衡冰冷同位素密度梯度介质加入无菌的五毫升聚苯乙烯烧瓶管中。将细胞均质从50毫升锥形管转移到这种烧瓶管中。

和移液器上下混合好。再添加 500 微升 1X HBSS，以密封顶部。在4摄氏度下，将800倍G的细胞离心20分钟。

小心吸气介质中含有麦林的上清液，而不干扰管底的细胞颗粒。将含有5%胎儿牛血清的100微升PBS加入颗粒中，并重新悬浮D组细胞。然后将α小鼠CX3CR1APC抗体加入细胞，在黑暗中在4摄氏度下孵育一小时。

用五毫升PBS清洗细胞一次。在摄氏4度下将细胞在360倍G下离心8分钟。吸制上一液，然后将细胞颗粒重新悬浮在300微升PBS中，进行事实分析。

在将FK结合蛋白二联剂AP注射到MaFIA小鼠以消耗巨噬细胞后，与受控制的车辆治疗小鼠相比，在AP治疗小鼠的DAG中，GFP阳性细胞明显丧失。事实分析表明，在AP治疗的小鼠中，GFP高种群的耗竭成功，并证明了分离细胞的高质量。车辆处理动物 DRG 中 4% 的分离细胞是 GFP 高巨噬细胞。

相比之下，在AP治疗的小鼠中，只有0.4%的 DRG 细胞是 GFP 高巨噬细胞。从野生型小鼠机械分离的 DRG 细胞被染有 alpha 小鼠 CX3CR1-APC 抗体。6%的 DRG 细胞为 CX3CR1 阳性巨噬细胞。

当用碘化丙二基评估细胞的生存能力时，它揭示了超过80%的新鲜分离的 DRG 细胞是可行的。如果注意到不满意的细胞产量，可能怀疑DG组织不充分或过度均质。此外，DRG 解剖可能需要初学者反复练习。

我们的协议的应用可能可以扩展，以研究其他非神经元细胞，如卫星细胞和T细胞。进一步的研究可能需要确认细胞分离的有效性。