Новые доказательства подразумевает вклад спинного корня ганглия макрофаги невропатической боли развития и аксонального ремонта в контексте травмы нерва. Быстро фенотипирование реакции спинного корня ганглия макрофаги желательно определить неизвестные нейроиммунные факторы. Здесь мы демонстрируем, как наша лаборатория быстро и эффективно изолирует макрофаги от спинного корня ганглиев с помощью протокола механической диссоциации без ферментов.
Этот протокол гораздо меньше времени по сравнению со стандартными энзиматических протоколов, и мы регулярно использовали его для нашего флуоресценции активированных клеток сортировки анализа. Перед началом эксперимента подготовьте рабочий раствор градиентной среды плотности, смешивая девять томов среды с одним объемом кальция и магния 10X HBSS и держите его на льду. Подтвердите, что мышь полностью анестезируется из-за отсутствия реакции на щепотку задней лапы.
Начните с размещения обезболивающей мыши внутри химического дыма капот в положении на спине с четырьмя лапами обеспеченных лентой. Используйте типсы, чтобы поднять кожу ниже грудной клетки. А потом хирургическими ножницами сделайте небольшой разрез, чтобы разоблачить печень и диафрагму.
Используя те же ножницы, вырезать диафрагму и грудную клетку. А затем откройте плевральной полости подвергать бьющееся сердце. Далее с ножницами радужной оболочки глаза, быстро вырезать право предсердий придаток.
После того, как кровотечение отмечается, вставьте 30-го калибра иглы в задней части левого желудочка и медленно вводить 10 миллилитров предварительно охлажденных 1X PBS для опровержки животного. Для выполнения спинной ламинэктомии поместите мышь в положение, подверженное. Используйте скальпель размером 11, чтобы сделать два продольных глубоких разреза, начиная от грудной области до сакральной области.
Затем удалите кожу подвергая спинной мышечный слой. Затем с помощью rongeur Фридмана-Пирсона снимите соединительные ткани и мышцы до тех пор, пока не будут раскрыты люмбосакальные процессы позвоночника и двусторонние поперечные процессы. Во-первых, использовать Фридман-Пирсон rongeur тщательно открыть спинной позвоночник, а затем переключаться между Фридман-Пирсон rongeur и Noyes весной ножницы для удаления позвонков костей, подвергая спинного мозга с нетронутыми спинного нерва прилагается.
Тщательно вскрыть ипсилатеральной и контралатеральной поясничной DRG. Поместите его в один миллилитр ледяного кальция и без магния 1X HBSS в гомогенизатор ткани Dounce. Гомогенизировать drG ткани в Dounce гомогенизатор с рыхлой пестик в 20 до 25 раз.
Поместите стерильный 70-микрометровый нейлоновый клеточный ситечко в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку. Используйте 800 микролитров ледяного кода 1X HBSS, чтобы промокнуть клеточный ситечко. Используйте пипетку, чтобы собрать подвеску гомогенизированной ткани из гомогенизатора на ситечко влажных клеток, и собрать его в 50-миллилитровую коническую трубку.
Промыть гомогенизатор дважды с 800 микролитров ледяной 1X HBSS, собирая жидкость в той же 50-миллилитровой конической трубки для повышения урожайности. Добавьте 1,5 миллилитров equilibrated ледяной изотонической плотности градиента среды в стерильную пятими миллилитровую полистироловую колбу. Перенесите гомогенат клетки из 50-миллилитровой конической трубки в эту колбу.
И пипетки вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать. Добавьте еще 500 микролитров 1X HBSS, чтобы запечатать верх. Центрифуга клетки при 800 раз G в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию.
Тщательно аспирировать супернатант, содержащий миелин в среде, не нарушая ячейки гранулы в нижней части трубки. Добавьте 100 микролитров PBS, содержащих 5%фетальную сыворотку крупного рогатого скота, в гранулы и повторно приостановив DRG-клетки. Затем добавьте альфа-мышь CX3CR1 APC антитела к клеткам и инкубировать в темноте при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа.
Вымойте клетки один раз с пятью миллилитров PBS. Центрифуга клетки при 360 раз G в течение восьми минут при четырех градусах по Цельсию. Аспирировать супернатант, а затем повторно приостановить ячейки гранулы в 300 микролитров PBS для анализа фактов.
После внутриперитонеальной инъекции FK-связывающего белка димеризатора AP в мышей MaFIA для истощения макрофагов, произошла значительная потеря положительных клеток GFP в DRGs обработанных AP мышей по сравнению с контролируемым транспортным средством обработанных мышей. Анализ фактов показал успешное истощение высокой популяции GFP у обработанных AP мышей и продемонстрировал высокое качество изолированных клеток. 4% от общего количества изолированных клеток из DRG транспортных средств обработанных животных были GFP высоких макрофагов.
В отличие от этого только 0,4% от общего числа клеток DRG были GFP высоких макрофагов в AP-обработанной мыши. Механически изолированные клетки DRG от диких мышей типа были окрашены альфа-мышью CX3CR1-APC антитела. 6% клеток DRG были положительными макрофагами CX3CR1.
Когда жизнеспособность клеток оценивалась с помощью йодида пропидия, выяснилось, что более 80% свежеиспеченные клетки DRG были жизнеспособными. Если отмечается неудовлетворительный выход клеток, можно заподозрить недостаточную или чрезмерную гомогенизацию ткани DRG. Кроме того, рассечение DRG может потребовать повторной практики для начинающих.
Скорее всего, применение нашего протокола может быть расширено для изучения других не нейрональных клеток, таких как спутниковые клетки и Т-клетки. Для подтверждения эффективности изоляции клеток могут потребоваться дальнейшие исследования.
