خلايا SBNET المتمايزة بشكل جيد بطيئة النمو ويصعب نشرها. خطوط الخلية القليلة المنشأة ليست متاحة بسهولة للباحثين. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير هذا البروتوكول ثقافة 3D.
وميزة هذه التقنية على الطريقة التقليدية لإنشاء خط الخلية SBNET هو أنه يمكن الحصول على الثقافات 3D واختبار المخدرات يمكن القيام به في غضون ثلاثة أسابيع. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أورام الغدد الصماء العصبية الأخرى مثل أورام الغدد الصماء العصبية من البنكرياس. بعد الحصول على عينة SBNET المريضة التي تم استئصالها، قم بقطعها إلى مكعبات خمسة ملليمترات وتخزينها في 25 ملليلتر من متوسط DMEM F12 في أنبوب مخروطي للنقل.
احتضان الأورام في غسل المتوسطة أعدت وفقا لتوجيهات المخطوطات لمدة 15 دقيقة. ثم نقلها إلى طبق جديد و mince لهم إلى أقل من قطعة ملليمتر واحد باستخدام مقص منحنى معقمة. نقل الأنسجة المفروم إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر يحتوي على 25 ملليلتر من غسل المتوسطة، ثم الطرد المركزي العينة في 500 مرة ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.
تجاهل السوبر و resuspend الكريات في 10 ملليلتر من غسل المتوسطة مع الكولاجيناز وDNase. السماح للأورام المفرومة لهضم في 37 درجة مئوية مع اهتزاز بطيء لمدة 90 دقيقة. من المهم عدم هضم عينات الورم.
الكثير من الانزيم أو فترة حضانة أطول سوف تقتل الخلايا SBNET. بعد اكتمال الهضم، الطرد المركزي الأنبوب في 500 مرات ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. تجاهل افراط و resuspend بيليه في 15 ملليلتر من غسل المتوسطة.
ضع مصفاة 70 ميكرومتر على رأس أنبوب جديد 50 ملليلتر ونقل 10 ملليلتر من عازلة الغسيل من خلال المصفاة. دوامة العازلة غسل داخل أنبوب لمنع الخلايا من التمسك الجانبين. ثم تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. تجاهل supernatant و resuspend بيليه في 200 ميكرولترات من غسل المتوسطة. ضع الأنبوب على الجليد واستخدم خمسة ميكرولترات من الخلايا لعد الخلايا مع مقياس الدم.
حساب عدد الخلايا، ثم كرر الطرد المركزي لإزالة عظمى وإعادة تعليق الخلايا في ECM السائل بتركيز مليون خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك، نقل خمسة إلى 20 ميكرولترات من spheroids SBNET في ECM إلى لوحة 96 جيدا ووضع لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح ECM السائل لترسيخ. إضافة 200 ميكرولتررس من SBNET ثقافة المتوسطة لكل بئر تحتوي على spheroids أو ثقافة organoids في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية كما هو موضح سابقا.
استخدام ماصة P1000 لنقل organoids إلى أنبوب 1.5 ملليلتر والطرد المركزي الأنبوب في 1، 500 مرات ز لمدة دقيقة واحدة لإزالة عظمى. غسل الثقافة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي مرة أخرى لإزالة فائقة. ثم إصلاح organoids بإضافة 500 ميكرولترات من شبه شكلي واحتضان لهم لمدة 15 دقيقة.
بعد الحضانة، وغسل الثقافة مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. إضافة 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني مع 3 ٪ BSA و 0.1 ٪ تريتون X - 100 ل Permeabilize الثقافة. احتضان الأنبوب لمدة خمس دقائق ، ثم غسل organoids ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني و 3 ٪ BSA.
بعد ذلك ، احتضان الثقافة مع الأجسام المضادة الأولية لمدة ساعة واحدة ثم كرر يغسل مع برنامج تلفزيوني وBSA. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية وتكرار يغسل التأكد من التعرق والتخلص من جميع supernatant. لتصوير spheroids، إضافة خمسة microliters من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI واستخدام ماصة P20 لنقل خمسة ميكرولترات من spheroids إلى شريحة زجاجية.
ختم الشريحة مع غطاء وصورة مع المجهر المفلور باستخدام أهداف 10 و 20 و 40X. ميكانيكيا كسر ECM مع ماصة P1000 ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر معقمة. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 1،000 مرات ز في أربع درجات مئوية.
ثم إزالة جميع ناظر ووضع الأنبوب على الجليد. إضافة مرتين إلى أربعة أضعاف حجم ECM جديدة إلى بيليه وخلط محتويات أنبوب عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات مع التأكد من تجنب إدخال فقاعات الهواء. نقل خمسة إلى 20 ميكرولترات من ECM و SBNET خليط إلى لوحة جديدة 96 جيدا والسماح ECM لترسيخ.
ثم تغطية ECM الصلبة مع SBNET المتوسطة الجديدة ووضع لوحة في الحاضنة. إذا كان الشحن SBNET spheroids إلى معمل آخر، نقل spheroids مع ECM الجديدة إلى قارورة T25 والسماح ECM إلى ترسيخ. ملء القارورة مع SBNET الوسيلة spheroid، المسمار الغطاء على بإحكام، وإعداد حزمة الشحن.
عند تلقي ثقافة spheroid إزالة الوسيطة الثقافة وكرر الخطوات السابقة لوضع spheroids مرة أخرى في الثقافة. تم رصد معدل النمو spheroid SBNET مع التصوير المجهري. يستغرق حوالي 14 يوماً لsBNET spheroids إلى مضاعفة في الحجم عند تغيير وسائط الثقافة مرة واحدة في الأسبوع.
بعد 14 يوما في الثقافة، لا تزيد spheroids SBNET في الحجم. كانت الـ spheroids ملطخة بأجساد مضادة محددة ضد synaptophysin وchromogranin A وSSTR2 وصورت باستخدام المجهر المناعي. وأظهرت البيانات أن هذه العلامات مترجمة في السيتوبلازم وعند غشاء خلايا SBNET.
لضمان خصوصية الأجسام المضادة ، تم إجراء نفس إجراءات التلطخ على خط organoid من ورم البنكرياس الذي لا يعبر عن synaptophysin ، chromogranin A و SSTR2 ولم يتم الكشف عن أي إشارة خضراء. الميزة الرئيسية للتصوير المناعي للفلوروس هو أنه يمكن القيام به في غضون أربع ساعات وإعطاء معلومات تلطخ مماثلة للكيمياء المناعية. زراعة SBNET كما spheroids هو تقنية قيمة لتحديد الأدوية التي يمكن أن تمنع نمو SBNET.
تم التعامل مع spheroids مع rapamycin ومثبط MTOR. بعد خمسة أيام، وشكل الروسي المعالج بالراباميسين بنية تشبه العنب وأصبح مُنقبًا أو نخريًا. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن قبل الرطب مصفاة الخلية وأنبوب جمع مع غسل المتوسطة.
وهذا سيمنع خلايا SBNET من التمسك مصفاة الخلية والأنابيب البلاستيكية. مع هذا البروتوكول، يمكن للعلماء والأطباء إنشاء SBNET الثقافات spheroid من الأورام التي تم استئصالها، ومشاركتها مع مختبرات أخرى، واستخدامها لاختبار الأدوية وافقت ادارة الاغذية والعقاقير.
