Nous avons montré que les génomes viraux du groupe IV codent de courtes étendues de séquences de protéines hôtes. Ces séquences peuvent être trouvées dans les sites viraux de clivage de protéase. Ils sont utilisés pour la destruction ciblée des protéines hôtes, généralement des protéines impliquées dans la génération des réponses immunitaires.
Un avantage majeur de l’utilisation d’analyses de protéase est qu’il élimine la complexité d’une cellule et montre si oui ou non une protéase virale peut fendre une séquence particulière. Ainsi, lorsque nous avons analysé les séquences de Zika SSHHPS, nous avons constaté que la protéase pouvait réduire les séquences dans les protéines impliquées dans la génération de réponses immunitaires et que certaines de ces protéines avaient également un rôle dans le développement du cerveau et des yeux. Lors de l’exécution de cette technique pour la première fois, il faut se rappeler que si le clivage n’est pas observé, il peut être dû à une variété de facteurs tels que l’activité de la protéase.
Jaimee Compton, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par ouvrir Protein BLAST et mettez les 20 acides aminés entourant la liaison scissile et la polyprotéine virale et sélectionnez les séquences protéiques non redondantes puis tapez dans le génome hôte à rechercher. Si nécessaire, sélectionnez PHI-BLAST et tapez dans une séquence de motifs où les supports carrés indiquent que l’un ou l’autre acide aminé dans les parenthèses peut être à la position de remplacement, puis frapper BLAST.
Classer l’ordre des frappes BLAST en fonction du nombre de résidus identiques ou tolérés consécutifs qui correspondent à une séquence de site de clivage. Dans la liste, sélectionnez les protéines contenant six résidus identiques ou similaires ou similaires à analyser dans les analyses de protéase. Construire un plasmide codant pour la protéine fluorescente cyan, jusqu’à 25 acides aminés de la séquence de clivage, et la protéine fluorescente jaune.
Ensuite, préparez les substrats CFP et YFP en inoculant quatre flacons de quatre litres avec 25 millilitres d’une culture nocturne. Secouez les cultures à 37 degrés Celsius et surveillez la croissance toutes les heures par spectroscopie UV-Vis à 600 nanomètres. Lorsque les bactéries atteignent une absorption d’environ un, induire l’expression des protéines en ajoutant 0,5 millilitres d’un IPTG molaire à chaque flacon, puis abaisser la température de l’incubateur secouant à 17 degrés Celsius et permettre à l’expression de continuer toute la nuit pendant 17 à 20 heures.
Le lendemain, pelleter les bactéries par centrifugation à 7000 fois g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Retirez et jetez le liquide, puis stockez les granulés à moins 80 degrés Celsius ou procédez à la lyse cellulaire. Pour lyse les cellules, préparer 100 millilitres de tampon de lyse selon les instructions manuscrites, résuspendre les granulés dans le tampon, et transférer 25 à 25 millilitres de la suspension à 50 millilitres tubes coniques jetables.
Placez les tubes dans un bécher en plastique avec de l’eau glacée, puis insérez la pointe du sonicateur dans le tube de sorte que la pointe est d’environ un centimètre du fond du tube et sonicate le lysate 10 à 20 fois jusqu’à ce qu’il devienne fluide et liquéfié. Après la sonication, transférer le lysate dans des tubes de centrifugeuse à grande vitesse et le centrifuger à 20 500 x g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Transférer le supernatant dans une bouteille propre et jeter les granulés.
Chargez le lysate sur la colonne de nickel puis lavez la colonne avec deux volumes de colonne de tampon A suivis de cinq volumes de colonne de B.Absorbance tampon de 20% à 280 nanomètres augmentera pendant le lavage pendant que les contaminants s’élit de la colonne. Continuer le lavage jusqu’à ce que l’A280 revienne aux valeurs de base. Ensuite, élitez la protéine avec deux à trois volumes de colonne de 100% tampon B et de recueillir des fractions de 10 millilitres, en s’assurant de mesurer l’A280 de chaque fraction.
Préparez huit mélanges de réactions selon les directions manuscrites et pipette 45 microlitres de chaque mélange dans les trois premiers puits de chaque rangée d’une plaque noire de 96 puits de demi-surface. Configurez le lecteur de plaque pour la détection simultanée de la florescence à deux longueurs d’onde avec un réglage fixe du tube photomultiplier. Programmez le temps de lecture à 20 à 30 minutes avec une lecture par minute et sélectionnez les puits à lire.
Insérez la plaque dans la machine et démarrez la lecture, en surveillant les rapports d’émission au fil du temps. Exécuter une lecture de point de terminaison de la plaque contenant le substrat non coupé. Retirer la plaque et pipette cinq microlitres d’enzyme dans chaque puits.
On peut enregistrer la première colonne comme un contrôle non coupé. Ensuite, relisez la plaque pendant 20 à 30 minutes, en vous assurant de régler le lecteur de plaque à des valeurs absolues de sortie. Une fois la lecture terminée, sceller la plaque avec du film pour éviter l’évaporation et la laisser toute la nuit à température ambiante pour permettre à l’enzyme de couper complètement le substrat.
Après 24 heures, retirez le film et effectuez une lecture de fin de la plaque. Faire la moyenne des ratios d’émissions et les enregistrer comme étant réduits. Confirmez le clivage du substrat à l’aide de SDS-PAGE.
Chargez un marqueur de poids moléculaire dans la première ou la dernière voie et chargez cinq microlitres de chaque mélange de réaction dans une voie du gel, en commençant par la réaction non coupée. Fixez les électrodes du réservoir de gel à l’alimentation électrique et exécutez les produits à 110 volts pendant 60 minutes. Retirez le gel de la cassette à l’aide d’un outil de fissuration et submergez-le en cinq à 10 millilitres de solution de coloration.
Après une à 24 heures, retirer l’excès de taches et plonger le gel dans l’eau. Ensuite, prenez une photo du gel à l’aide d’un imageur de gel. Pour préparer la structure protéique, chargez le fichier PDB protéique dans le MEO.
Cliquez sur Sélectionnez et Solvant, puis supprimez le solvant. Ouvrez le panneau de préparation de structure à partir de la barre de menu supérieure Compute et corrigez automatiquement tous les éléments structurels en cliquant sur Correct. Protonate la structure en cliquant sur Protonate 3D.
Ajoutez des charges partielles à la protéine en ouvrant le panneau Charges partielles et en sélectionnant AMBER 99 et ajustez les hydrogènes et les paires solitaires au besoin. Ensuite, enregistrez le fichier de structure. Pour construire la structure des peptides de substrat et trim14, ouvrez le panneau Protein Builder, entrez dans la séquence du substrat et sélectionnez Auto Repack.
Ensuite, définissez la géométrie comme étendue et cliquez sur Build. Enfin minimiser la structure et l’enregistrer comme un fichier PDB. Amarrer les peptides de substrat à VEEV-nsP2 à l’aide du logiciel PyRx AudoDock 4.2.
Chargez la protéine, cliquez à droite sur le nom et sélectionnez Make Macromolecule pour préparer le fichier d’amarrage PDBQT. Chargez ensuite la molécule de substrat et sélectionnez Make Ligand pour préparer le fichier d’amarrage ligand. Démarrez l’assistant AutoDock sur le panneau d’amarrage en bas et sélectionnez les fichiers ligand et protéines préparés.
Définissez la poche de liaison protéique en ajustant manuellement la dimension de la grille, puis exécutez AuotGrid. Ensuite, exécutez AutoDock et sélectionnez la méthode de l’algorithme génétique lamarckien. Cliquez sur Paramètres d’amarrage et définissez le nombre de courses GA à 50, puis cliquez sur Forward pour démarrer la course à l’amarrage.
Lorsque AutoDock est terminé, ouvrez le panneau Analyser les résultats et inspectez toutes les poses de liaison prévues. Sélectionnez le meilleur modèle avec l’énergie de liaison la plus basse prévue et des interactions de liaison raisonnables entre le cis-477 et le substrat sur le site de clivage, puis enregistrez-le comme fichier PDB pour d’autres simulations MD. Après avoir lu les poses de liaison avec AutoDock, il est important d’effectuer une analyse post-amarrage pour identifier le modèle de liaison plausible pour le raffinement avec des simulations MD.
Ce protocole a été utilisé pour trouver de courtes étendues de séquences homologues de protéines pathogènes de l’hôte ou de SSHHPS dans la protéase du virus Zika ns2B/3. Quatre cibles protéiques hôtes ont été identifiées. FOXGS, SFRP1, un sous-unité Gsalpha d’une bibliothèque rétinienne cDNA, et le NT5M mitochondrial 5'3'nucléotidase.
Les alignements de séquences du SSHHPS ont permis des différences spécifiques aux espèces dans les séquences du site de clivage. La séquence SFRP1 était identique chez l’homme et les poulets, ce qui est remarquable parce que le virus Zika peut induire la mortalité et la microcéphalie chez les embryons de poulet. L’essai continu a été employé pour mesurer les paramètres cinétiques stables d’état et les constantes d’inhibition pour les séquences virales de polyprotéine et l’essai discontinu a été employé pour obtenir l’information qualitative de clivage, telle que le clivage d’une séquence particulière ou l’inhibition de la protéase par divers composés.
Un modèle de la jonction vénézuélienne d’encéphalite équine nsP1-nsP2 a été fait utilisant dans les méthodes de silico. Pour la protéase nsP2, l’allongement de la séquence du substrat et la réduction de la force ionique du tampon ont conduit à une réduction significative de la constante michaelis du clivage d’une séquence de virus de la forêt de Semliki. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important d’exécuter les contrôles.
Les substrats contenant les séquences virales du site de clivage protéase doivent être testés avant de procéder à l’analyse de la séquence SSHHPS. Si le clivage d’une protéine hôte est observé, des expériences de suivi devraient être menées pour confirmer que cette protéine hôte affecte la réplication virale. Cela peut être fait en surexprimant ou en faisant taire la protéine, puis en examinant les effets sur la réplication virale.
Le groupe IV contient un grand nombre d’agents pathogènes nouveaux et émergents. Les séquences SSHHPS relient des protéines et des voies hôtes spécifiques aux protéases virales d’une manière très prévisible.
