Мы показали, что вирусные геномы группы IV кодируют короткие участки последовательностей белка-хозяина. Эти последовательности можно найти в вирусных сайтов расщепления протеазы. Они используются для целенаправленного уничтожения белков-хозяй, как правило, белков, участвующих в генерации иммунных реакций.
Основным преимуществом использования протеазы анализов является то, что он удаляет сложность клетки и показывает, действительно ли вирусная протеаза может расщепить определенную последовательность. Итак, когда мы проанализировали последовательности вируса Зика SSHHPS, мы обнаружили, что протеаза может сократить последовательности в белках, участвующих в генерации иммунных реакций, и что некоторые из этих белков также сыграли роль в развитии мозга и глаз. При выполнении этого метода в первый раз, следует помнить, что если расщепление не наблюдается, что это может быть связано с различными факторами, такими как активность протеазы.
Демонстрацией процедуры будет Джейми Комптон, техник из моей лаборатории. Начните с открытия Protein BLAST и поместите 20 аминокислот, окружающих scissile связи и вирусного полипротеина и выбрать неизлишние последовательности белка затем введать в геном хозяина для поиска. При необходимости выберите PHI-BLAST и ввемите в последовательность шаблонов, где квадратные скобки указывают на то, что либо аминокислота в скобках может быть в положении замены, а затем ударить BLAST.
Порядок ранга BLAST хитов на основе количества последовательных идентичных или допускаемых остатков, которые соответствуют последовательности сайта расщепления. Из списка выберите белки, содержащие шесть или более идентичных или аналогичных остатков для анализа в протеазных анализах. Постройте плазмидную кодировку цианового флуоресцентного белка, до 25 аминокислот последовательности расщепления и желтого флуоресцентного белка.
Далее подготовьтесь к субстратам CFP и YFP, привив четыре четырехлитровые колбы с 25 миллилитров ночной культуры. Встряхните культуры при 37 градусах цельсия и отслеживай рост ехай с помощью уф-виз спектроскопии на 600 нанометров. Когда бактерии достигают поглощения около одного, индуцировать выражение белка, добавив 0,5 миллилитров одного молярного IPTG к каждой колбе, а затем снизить температуру встряхивания инкубатора до 17 градусов по Цельсию и позволяют выражение продолжать на ночь в течение 17 до 20 часов.
На следующий день, гранулы бактерий центрифугации в 7000 раз г в течение 10 минут при 4 градусах по Цельсию. Удалите и отбросьте жидкие средства массовой информации затем хранить гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию или приступить к лизу клеток. Чтобы вылизать клетки, подготовьте 100 миллилитров буфера лиза в соответствии с рукописными указаниями, повторно посовелите гранулы в буфер и перенесите от 25 до 25 миллилитров суспензии в 50 миллилитров одноразовых конических трубок.
Поместите трубки в пластиковый стакан с ледяной водой, а затем вставьте наконечник sonicator в трубку, так что кончик составляет около одного сантиметра от нижней части трубки и sonicate лисировать 10 до 20 раз, пока он не станет жидкости и liquified. После sonication, передача ликата на высокой скорости центрифуги труб и центрифуги его на 20, 500 х г в течение 30 минут при 4 градусах по Цельсию. Перенесите супернатант в чистую бутылку и отбросьте гранулы.
Загрузите лисат на столбец никеля, затем вымойте столбец двумя объемами столбца буфера А, а затем пятью объемами столбца 20%buffer B.Absorbance на 280 нанометров увеличится во время стирки, так как загрязняющие вещества выходят из колонны. Продолжайте мыть, пока A280 не вернется к базовым значениям. Затем уберите белок с двумя-тремя объемами колонки 100%buffer B и соберите 10 миллилитров фракций, убедившись, что для измерения A280 каждой фракции.
Подготовьте восемь смесей реакций в соответствии с рукописными указаниями и пипетку 45 микролитров каждой смеси в первые три колодца каждого ряда черной половины площади 96-колодец пластины. Настройка считыватель пластин для одновременного обнаружения флоресцев на двух длинах волн с фиксированной настройкой трубки photomultiplier. Программа времени чтения до 20 до 30 минут с одним чтением в минуту и выбрать скважины для чтения.
Вставьте пластину в машину и запустите считыв, отслеживая коэффициенты выбросов с течением времени. Вы запустите конечную точку чтения пластины, содержащей необрезанный понюхать. Удалите пластину и пипетку пять микролитров фермента в каждую колодец.
Первый столбец можно сохранить как необрезанный элемент управления. Затем прочитайте пластину снова в течение 20 до 30 минут, убедившись, что установить считыватель пластины для вывода абсолютных значений. После того, как чтение завершено, печать пластины с пленкой, чтобы предотвратить испарение и оставить его на ночь при комнатной температуре, чтобы фермент полностью сократить субстрат.
Через 24 часа снимите пленку и выполните чтение конечной точки пластины. Среднее соотношение выбросов и записывать их как сокращение. Подтвердите расщепление субстрата с помощью SDS-PAGE.
Загрузите молекулярный маркер веса в первую или последнюю полосу и загрузите пять микролитров каждой реакционной смеси в полосу геля, начиная с необрезанной реакции. Прикрепите электроды гелеобразного бака к источнику питания и запустите продукты на 110 вольт в течение 60 минут. Удалите гель из кассеты с помощью инструмента растрескивания и погрузите его в 5-10 миллилитров раствора окрашивания.
Через 1-24 часа удалите лишнее пятно и погрузите гель в воду. Затем смойте гель с помощью гель-изображения. Чтобы подготовить белковую структуру, загрузите файл белка PDB в МЧС.
Нажмите Выберите и Solvent, а затем удалить растворитель. Откройте панель pPreparation Structure из верхней панели меню Compute и автоматически исправите все структурные элементы, нажав на Correct. Протонировать структуру, нажав Протонат 3D.
Добавьте частичные заряды к белку, открыв панель частичных зарядов и выбрав AMBER 99 и отрегулируйте водород и одинокие пары по мере необходимости. Затем сохраните файл структуры. Чтобы построить структуру для пептидов субстрата и TRIM14, откройте панель Protein Builder, введите последовательность субстрата и выберите Auto Repack.
Затем установите геометрию как расширенную и нажмите на Build. Наконец свести к минимуму структуру и сохранить его в качестве файла PDB. Пристыковать пептиды субстрата к VEEV-nsP2 с помощью программного обеспечения PyRx AudoDock 4.2.
Загрузите белок, нажмите правой кнопкой мыши и выберите Make Macromolecule, чтобы подготовить файл стыковки PDB'T. Затем загрузите молекулу субстрата и выберите Make Ligand, чтобы подготовить файл стыковки лиганда. Запустите мастера AutoDock на стыковочной панели внизу и выберите подготовленные лигандовые и белковые файлы.
Определите белково-связывающий карман, вручную регулируя размер сетки, а затем запустите AuotGrid. Затем запустите AutoDock и выберите метод ламаркского генетического алгоритма. Нажмите на параметры стыковки и установите количество GA работает до 50 затем нажмите на вперед, чтобы начать стыковку перспективе.
Когда AutoDock будет завершена, откройте панель анализировать результаты и проинспектируйте все прогнозируемые позы связывания. Выберите лучшую модель с самой низкой прогнозируемой связывающей энергией и разумными связывающими взаимодействиями между cis-477 и субстратом на сайте расщепления, затем сохраните ее в виде файла PDB для дальнейшего моделирования MD. После прочтения связывающих поз с AutoDock, важно выполнить пост-доковый анализ, чтобы определить правдоподобную модель связывания для уточнения с помощью моделирования MD.
Этот протокол был использован, чтобы найти короткие участки гомологичный хост-патоген белковых последовательностей или SSHHPS в вирусе Зика ns2B/3 протеазы. Было выявлено четыре цели белка-хозяина. FOXGS, SFRP1, подразделение Gsalpha из библиотеки кДНК сетчатки и митохондриальная 5'3'нуклеотидаза NT5M.
Последовательности выравнивания SSHHPS позволили видов конкретных различий в последовательности сайта расщепления. Последовательность SFRP1 была идентична у людей и кур, что примечательно, потому что вирус Зика может вызвать смертность и микроцефалию у куриных эмбрионов. Непрерывный анализ был использован для измерения устойчивых параметров состояния кинетического и ингибирования констант для вирусных последовательностьх полипротеина и прерывистый анализ был использован для получения качественной информации о расщеплении, таких как расщепление определенной последовательности или ингибирование протеазы различными соединениями.
Модель венесуэльского конского энцефалита nsP1-nsP2 была сделана с использованием силико методов. Для nsP2 protease удлинение последовательности субстрата и снижение ионной прочности буфера привело к значительному сокращению постоянной расщепления последовательности вируса Semliki Forest. При попытке этой процедуры важно запускать элементы управления.
Субстраты, содержащие вирусные последовательности участка расщепления протеазы, должны быть протестированы, прежде чем приступить к анализу последовательности SSHHPS. Если расщепление белка-хозяина наблюдается, последующие эксперименты должны быть проведены, чтобы подтвердить, что этот белок-хозяин влияет на репликацию вируса. Это может быть сделано путем переэкспрессии или заглушая белок, а затем изучение влияния на репликацию вируса.
Группа IV содержит большое количество новых и возникающих патогенов. Последовательности SSHHPS связывают специфические протеины хозяина и пути с вирусными proteases в очень предсказуемом образе.
