Análise do Grupo IV Viral SSHHPS usando métodos in vitro e em silico

Mostramos que genomas virais do grupo IV codificam pequenos trechos de sequências proteicas hospedeiras. Essas sequências podem ser encontradas nos locais de decote protease viral. Eles estão sendo usados para a destruição direcionada de proteínas hospedeiras, tipicamente proteínas envolvidas na geração das respostas imunes.

Uma grande vantagem do uso de ensaios protease é que ele remove a complexidade de uma célula e mostra se uma protease viral pode ou não cortar uma sequência específica. Assim, quando analisamos as sequências de Zika SSHHPS, descobrimos que a protease poderia cortar sequências em proteínas envolvidas na geração de respostas imunes e que algumas dessas proteínas também tinham papéis no desenvolvimento cerebral e ocular. Ao realizar essa técnica pela primeira vez, deve-se lembrar que se o decote não for observado, que pode ser devido a uma variedade de fatores, como a atividade da protease.

Demonstrando o procedimento será Jaimee Compton, uma técnica do meu laboratório. Comece abrindo protein BLAST e coloque os 20 aminoácidos ao redor da ligação scissile e a poliproteína viral e selecione sequências proteicas não redundantes, em seguida, digite no genoma hospedeiro para ser pesquisado. Se necessário, selecione PHI-BLAST e digite uma sequência de padrão onde os suportes quadrados indicam que qualquer aminoácido dentro dos suportes pode estar na posição de substituição e, em seguida, acerte BLAST.

Classificar a ordem dos hits BLAST com base no número de resíduos idênticos ou tolerados consecutivos que correspondem a uma sequência de local de decote. Na lista, selecione as proteínas contendo seis ou mais resíduos idênticos ou similares para análise nos ensaios protease. Construa um plasmídeo codificando a proteína fluorescente ciano, até 25 aminoácidos da sequência de decotes, e a proteína fluorescente amarela.

Em seguida, prepare os substratos CFP e YFP inoculando quatro frascos de quatro litros com 25 mililitros de uma cultura durante a noite. Agite as culturas a 37 graus Celsius e monitore o crescimento de hora em hora pela espectroscopia UV-Vis a 600 nanômetros. Quando as bactérias atingem uma absorção de cerca de um, induza a expressão proteica adicionando 0,5 mililitros de um IPTG molar a cada frasco, em seguida, reduza a temperatura da incubadora de agitação para 17 graus Celsius e permita que a expressão continue durante a noite por 17 a 20 horas.

No dia seguinte, pelota as bactérias por centrifugação a 7000 vezes g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Remova e descarte a mídia líquida e, em seguida, armazene as pelotas a menos 80 graus Celsius ou prossiga com a lise celular. Para lise as células, prepare 100 mililitros de tampão de lise de acordo com as instruções do manuscrito, resuspenque as pelotas no buffer e transfira de 25 a 25 mililitros da suspensão para tubos cônicos descartáveis de 50 mililitros.

Coloque os tubos em um béquer plástico com água gelada e insira a ponta do sonicador no tubo de modo que a ponta esteja a cerca de um centímetro da parte inferior do tubo e sonicar o lisato 10 a 20 vezes até que ele se torne fluido e liquefeito. Após a sônicação, transfira o lise para tubos de centrífugas de alta velocidade e centrifuá-lo a 20,500 x g por 30 minutos a 4 graus Celsius. Transfira o supernatante para uma garrafa limpa e descarte as pelotas.

Carregue o lise na coluna de níquel e lave a coluna com dois volumes de coluna de tampão A seguidos por cinco volumes de coluna de 20% tampão B.A absorção a 280 nanômetros aumentará durante a lavagem como contaminantes elute da coluna. Continue lavando até que o A280 retorne aos valores básicos. Em seguida, elute a proteína com dois a três volumes de coluna de 100% tampão B e coletar frações de 10 mililitros, certificando-se de medir o A280 de cada fração.

Prepare oito misturas de reações de acordo com as instruções do manuscrito e pipetas 45 microliters de cada mistura nos três primeiros poços de cada linha de uma placa preta de meia-área de 96 poços. Configure o leitor de placas para detecção simultânea de florescência em dois comprimentos de onda com uma configuração fixa do tubo fotomultiplier. Programe o tempo de leitura para 20 a 30 minutos com uma leitura por minuto e selecione os poços a serem lidos.

Insira a placa na máquina e inicie a leitura, monitorando as relações de emissão ao longo do tempo. Execute uma leitura final da placa contendo o substrato sem cortes. Remova a placa e a pipeta cinco microliters de enzima em cada poço.

Pode-se salvar a primeira coluna como um controle sem cortes. Em seguida, leia novamente a placa por 20 a 30 minutos, certificando-se de definir o leitor de placas para produzir valores absolutos. Uma vez que a leitura esteja completa, sele a placa com filme para evitar a evaporação e deixe-a durante a noite à temperatura ambiente para permitir que a enzima corte completamente o substrato.

Após 24 horas, remova o filme e realize uma leitura final da placa. Média das taxas de emissão e registo-los como corte. Confirme o decote do substrato usando SDS-PAGE.

Carregue um marcador de peso molecular na primeira ou última pista e carregue cinco microliters de cada mistura de reação em uma faixa do gel, começando com a reação sem cortes. Conecte os eletrodos do tanque de gel à fonte de alimentação e execute os produtos a 110 volts por 60 minutos. Remova o gel do usando uma ferramenta de rachaduras e submerse-o em cinco a dez mililitros de solução de coloração.

Após uma a 24 horas, remova o excesso de mancha e submerse o gel na água. Em seguida, tire uma foto do gel usando um imager de gel. Para preparar a estrutura proteica, carregue o arquivo PDB proteico em MOE.

Clique em Selecionar e Solvente e, em seguida, exclua o solvente. Abra o painel Depreparação de estrutura da barra de menu superior compute e corrija automaticamente todos os itens estruturais clicando em Corrigir. Protonar a estrutura clicando em Protonato 3D.

Adicione cargas parciais à proteína abrindo o painel Cargas Parciais e selecionando AMBER 99 e Ajuste os hidrogênios e pares solitários conforme necessário. Em seguida, salve o arquivo da estrutura. Para construir a estrutura para os peptídeos do substrato e TRIM14, abra o painel Protein Builder, digite a sequência do substrato e selecione Auto Repack.

Em seguida, defina Geometria como Estendida e clique em Construir. Por fim, minimize a estrutura e salve-a como um arquivo PDB. Docas os peptídeos substratos para VEEV-nsP2 usando o software PyRx AudoDock 4.2.

Carregue a proteína, clique com o botão direito do mouse no nome e selecione Fazer Macromolécula para preparar o arquivo de encaixe PDBQT. Em seguida, carregue a molécula do substrato e selecione Fazer Ligand para preparar o arquivo de acoplamento de ligantes. Inicie o assistente AutoDock no painel de acoplamento na parte inferior e selecione os arquivos de ligantes e proteínas preparados.

Defina o bolso de ligação de proteína ajustando manualmente a dimensão da grade e execute AuotGrid. Em seguida, execute o AutoDock e selecione o método do algoritmo genético lamarckiano. Clique em Docking Parameters e defina o número de execuções de GA para 50 e clique em Avançar para iniciar a execução de acoplamento.

Quando o AutoDock estiver completo, abra o painel Analisar resultados e inspecione todas as poses de vinculação previstas. Selecione o melhor modelo com a menor energia de ligação prevista e interações de ligação razoáveis entre o cis-477 e o substrato no site de decote e, em seguida, salve-o como um arquivo PDB para novas simulações de MD. Após a leitura das poses de vinculação com AutoDock, é importante realizar análises pós-acoplamento para identificar o modelo de ligação plausível para refinamento com simulações de MD.

Este protocolo foi usado para encontrar pequenos trechos de sequências de proteína hogênicas hospúricas ou SSHHPS no vírus Zika ns2B/3 protease. Foram identificados quatro alvos de proteína hospedeira. FOXGS, SFRP1, uma subunidade Gsalpha de uma biblioteca de cDNA de retina, e o mitocondrial NT5M 5'3'nucleotidase.

Os alinhamentos sequenciais do SSHHPS permitiram diferenças específicas das espécies nas sequências do local do decote. A sequência SFRP1 foi idêntica em humanos e galinhas, o que é notável porque o vírus Zika pode induzir mortalidade e microcefalia em embriões de frango. O ensaio contínuo foi utilizado para medir parâmetros cinéticos de estado estável e constantes de inibição para as sequências de poliproteína viral e o ensaio descontínuo foi utilizado para obter informações qualitativas de decote, como o decote de uma determinada sequência ou a inibição da protease por vários compostos.

Um modelo da junção de encefalite equina venezuelana nsP1-nsP2 foi feito utilizando-se em métodos de silico. Para o protease nsP2, alongar a sequência do substrato e reduzir a força iônica do buffer levou a uma redução significativa na constante michaelis de decote de uma sequência de vírus da Floresta Semliki. Ao tentar este procedimento, é importante executar os controles.

Substratos contendo as sequências virais do local do decote protease devem ser testados antes de prosseguir com a análise da sequência SSHHPS. Se o decote de uma proteína hospedeira for observado, devem ser realizados experimentos de acompanhamento para confirmar que essa proteína hospedeira afeta a replicação viral. Isso pode ser feito superexpressando ou silenciando a proteína e, em seguida, examinando os efeitos na replicação viral.

O grupo IV contém um grande número de patógenos novos e emergentes. As sequências SSHHPS conectam proteínas específicas do hospedeiro e caminhos com as proteases virais de forma muito previsível.