كانت هناك العديد من الجهود للحث على الترسب باستخدام الأيونيومايسين. ومع ذلك، فإن الإجراء الدقيق لهذه العملية غير محدد بوضوح في المؤلفات. نحن نقدم إجراء خطوة بخطوة للحث على الترسب باستخدام الأيونيومايسين.
الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هو حث الكريات الحمراء في الكريات الحمراء البشرية بطريقة موثوقة وقابلة للتكرار. للبدء، إضافة 500 ميكرولترات من الدم الكامل البارد في dextrose سيترات الحمضية إلى أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي الدم كله في 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة البلازما واضحة ومعطف رقيقة بافي باستخدام ماصة لمغادرة طبقة الحمراء الحمراء الحمراء.
إعداد لتر واحد من الحل رينجر تحتوي على 125 ميليمولار كلوريد الصوديوم، وخمسة كلوريد البوتاسيوم ميليمولار، واحد ميليمولار سلفات المغنيسيوم، 32 ملليمتر HEPES، خمسة الجلوكوز ميليمولار، وكلوريد الكالسيوم ميليمولار واحد. ضبط درجة اله pH إلى 7.4 عن طريق إضافة اثنين من قطرات microliter من هيدروكسيد الصوديوم الضرس واحد. لإعداد محلول Ringer الخالي من الجلوكوز، اتبع نفس البروتوكول ولكن لا تقم بتضمين الجلوكوز في المحلل.
غسل الكريات الحمراء مرتين في حل رينجر عن طريق تعليق بيليه الخلية في 1.5 ملليلتر من حل رينجر, الطرد المركزي في 700 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة عظمى. ثم جعل 0.4٪ الدماتوكريت عن طريق إعادة بناء 40 ميكرولترات من بيليه كريات الدم في 9، 960 ميكرولترات من محلول رينجر خالية من الجلوكوز للوصول إلى حجم النهائي من 10 ملليلتر. احتضان تعليق الخلية في 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام.
الحضانة المسبقة للكريات الحمراء في مخزن خال من الجلوكوز يؤدي بشكل كبير إلى حدوث تخدير الدم. تم الحصول على ارتفاع eryptosis بعد سبعة أيام من الحضانة المسبقة في عازلة خالية من السكر. قم بذوبان مليغرام واحد من ملح الكالسيوم الأيوني في 630 ميكرولتر من DMSO للوصول إلى تركيز نهائي من ميليمولار اثنين.
Aliquot في 20 ملليلتر وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية. تأخذ ملليلتر واحد من 0.4٪ المعدة الدم و إضافة 0.5 ميكرولترات من اثنين من المليمولار الأيونيميسين للوصول إلى تركيز نهائي من ميكرومولار واحد. احتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.
استخدام ملليلتر واحد من الدم الماتوسيت مع عدم وجود أي علاج الأيونيميسين كتحكم سلبي. جهاز طرد مركزي المعالجة الايونوميسين وغير المعالجة الدماتوكريتات في 700 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المواد الفوقية الخاصة بهم لترك كريات الخلية في الجزء السفلي من الأنابيب. غسل الخلايا ثلاث مرات مع الحل رينجر عن طريق تعليق الكريات الخلية في 1.5 ملليلتر من حل رينجر، الطرد المركزي في 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة والتخلص من االنبات.
لقياس الانحلال، إضافة ملليلتر واحد من الدم غير المعالجة 0.4٪ إلى أنبوب microcentrifuge واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية كتحكم سلبي من 0٪ انحلال الدم. لإعداد السيطرة الإيجابية على 100٪ من انحلال الدم، إضافة ملليلتر واحد من الدم غير المعالجة 0.4٪ إلى أنبوب ميكروسنتريفوج والطرد المركزي في 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة افرنح وإضافة ملليلتر واحد من الماء المقطر إلى بيليه الخلية إلى resuspend واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.
بعد ذلك، أضف ملليلتر واحد من الأيونيوميسين المعالجة 0.4٪ الدم إلى أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي الخلايا غير المعالجة، والخلايا المعالجة، والخلايا في الماء المقطر في 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل 200 ميكرولترات من superants في كل بئر من 96 بئر لوحة.
قياس امتصاص في 541 نانومتر باستخدام قارئ لوحة صغيرة. حساب الانحلال باستخدام المعادلة حيث A0، A100، و AT هي امتصاص كريات الدم الحمراء في حل رينجر في الماء وامتصاص المجعدات المعالجة بواسطة الأيونيميسين. تمييع مليلترين من العازلة ملزم 5X Annexin-V في ثمانية ملليلتر من برنامج تلفزيوني للحصول على 1X العازلة ملزمة.
ريسوسيبند كريات الخلايا المعالجة وغير المعالجة التي تمت معالجتها من الأينومايسين في ملليلتر واحد من العازلة 1X ملزمة. اتخاذ 235 microliters من تعليق الخلية في العازلة ملزمة وإضافة 15 microliters من الملحق الخامس اليكسا فلور 488 متقارن في أنبوب microcentrifuge. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في مكان مظلم.
أجهزة الطرد المركزي في 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة المناط. اغسل الخلايا مرتين بمخزن ملزم 1X عن طريق تعليق بيليه الخلية في 1.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للربط و 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
إزالة فائقة و resuspend الكريات الخلية في 250 ميكرولترات من 1X العازلة ملزمة لقياس تدفق الخلايا. الآن نقل 200 ميكرولترات من الملحقين الخامس الكريات الحمراء الملون إلى ملليمتر واحد جولة أسفل أنابيب البوليسترين متوافقة مع تدفق الخلايا. تسجيل الدخول إلى تدفق برنامج القياسات الكيسية وانقر على زر التجربة الجديدة.
انقر على زر أنبوب جديد. حدد الورقة العالمية واختر تحليل التطبيق لقياس شدة الفلوريسنس مع الطول الموجي للإثارة من 488 نانومتر و طول موجة من الانبعاثات من 530 نانومتر. تعيين عدد الخلايا إلى 20,000 ليتم جمعها لتحليل فرز الخلايا المُنشّط المُنشطة.
حدد الأنبوب المطلوب وانقر على زر التحميل. انقر على زر السجل للأمام مبعثر الجانب وتشتت القياس. كرر لكافة العينات.
انقر بزر الماوس الأيمن على زر العينة وانقر على تطبيق تحليل الدفعة لتوليد ملف النتيجة. انقر بزر الماوس الأيمن على زر العينة وانقر على توليد ملفات FSC. في هذا البروتوكول، كان علاج كريات الدم الحمراء بمحلول واحد من محلول الأيونيومايسين والرينغر الصغير لمدة ساعتين كافياً للحث على الضمور كما يتضح من وضع العلامات الناجحة مع Annexin-V Fluor 488 مع بعضها البعض وتحديد كميتها بواسطة تحليل FACS.
نتج عن تركيزات أعلى من الأيونيومايسين في خمسة و 10 ميكرومولار زيادة طفيفة في eryptosis. ومع ذلك، فإن هذه التركيزات أيضاً تعزز انحلال الدم. وكان حضانة الكريات الحمراء في محلول الأيونيوميسين ورينغر لمدة أقل من 30 دقيقة كافياً للحث على التخثر.
زيادة وقت الحضانة زيادة مستوى eryptosis لمدة تصل إلى ساعتين. ومع ذلك، أدى مزيد من فترة الحضانة في انخفاض طفيف في مستوى eryptosis. أعلى قيمة الانحلال بعد 180 دقيقة يفسر انخفاض في اعماب الدم بعد نفس القدر من الحضانة والخلايا أقل قابلية للحياة موجودة على 180 دقيقة من العلاج مع الأيونيوميسين.
وأظهرت كريات الدم الحمراء مع علاج الأيونيميسين إشارة الفلوريس مشرق لربط الملحقين الخامس إلى phosphatidyl سيرين في النشرة الخارجية. في المقابل، أظهرت الخلايا التي ليس لديها علاج إشارة الفلورس ضعيفة للغاية تشير إلى انخفاض شديد في الإرتب. مرحلة ما قبل الحضانة في عازلة خالية من الجلوكوز هو الزناد المهم لاستقراء اعماب الدم.
منذ لوحظ eryptosis في مجموعة واسعة من الأمراض، والتجارب التالية لهذا البروتوكول هي حقل محدد. في مختبرنا ، ونحن مهتمون في دراسة آثار الإبرى على الخصائص الحيوية الغشاء والتفاعلات الغشاء مع المواد النانوية. ويرتبط eryptosis مع عدد كبير من الأمراض بما في ذلك مرض السكري, فقر الدم المنجلي, وثالاسييميا.
وجود بروتوكول استنساخها لحفز eryptosis يمكن أن تساعد الباحثين في أي من هذه المجالات للتحقيق في مزيد من الأسئلة العلمية المحددة لكل مجال.
