Houve muitos esforços para induzir a eritose usando ionomicina. No entanto, o procedimento exato para este processo não está claramente descrito na literatura. Fornecemos um procedimento passo a passo para induzir a eritose usando ionomicina.
A principal vantagem deste procedimento é induzir a eritose em eritrócitos humanos de forma confiável e reprodutível. Para começar, adicione 500 microliters de sangue frio inteiro em citrato ácido dextrose a um tubo de microcentrifuge. Centrifugar o sangue inteiro a 700 vezes g durante cinco minutos em temperatura ambiente e remover o plasma claro e o fino casaco buffy usando uma pipeta para deixar a camada de eritrócito vermelho.
Prepare um litro de solução Ringer contendo cloreto de sódio de 125 milimilas, cinco cloreto de potássio milimila, um sulfato de magnésio milimil, 32 milimilas HEPES, cinco milialares de glicose e um cloreto de cálcio mililiar. Ajuste o pH para 7,4 adicionando duas gotas de microliter de um hidróxido de sódio molar. Para preparar a solução Ringer sem glicose, siga o mesmo protocolo, mas não inclua glicose na solução.
Lave os eritrócitos duas vezes na solução Ringer suspendendo a pelota celular em 1,5 mililitros da solução Ringer, centrifugando a 700 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente e removendo o supernatário. Em seguida, faça um hematócrito de 0,4%, reutilizando 40 microliters da pelota eritrócito em 9,960 microliters de solução Ringer sem glicose para atingir um volume final de 10 mililitros. Incubar a suspensão celular a 37 graus Celsius durante sete dias.
A pré-incubação de eritrócitos em um buffer sem glicose desencadeia significativamente a eritose. A eritpoose alta foi obtida após sete dias de pré-incubação no tampão sem açúcar. Dissolva um miligrama de sal de cálcio de ionomicina em 630 microliters de DMSO para alcançar uma concentração final de dois milimiliar.
Alíquota em 20 mililitros e armazenar a menos 20 graus Celsius. Tome um mililitro do hematócrito preparado de 0,4% e adicione 0,5 microlitres de dois milimíneos de ionomicina milimiliar para alcançar a concentração final de um micromolar. Incubar por duas horas a 37 graus Celsius.
Use um mililitro do hematócrito sem tratamento de ionomicina como controle negativo. Centrifugar a ionomicina tratada e hematócritos não tratados a 700 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente e remover seus supernantes para deixar as pelotas de célula na parte inferior dos tubos. Lave as células três vezes com a solução Ringer suspendendo as pelotas de células em 1,5 mililitros da solução Ringer, centrifugando a 700 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente e descartando os supernantes.
Para medir a hemólise, adicione um mililitro do hematócrito não tratado de 0,4% a um tubo de microcentrífuga e incubar por duas horas a 37 graus Celsius como o controle negativo de 0%hemólise. Para preparar o controle positivo da hemólise 100%, adicione um mililitro do hematócrito não tratado de 0,4% a um tubo de microcentrifuuge e centrífuga a 700 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente. Remova o supernasce e adicione um mililitro de água destilada à pelota celular para resuspengar e incubar por duas horas a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione um mililitro da ionomicina tratada 0,4% hematócrito a um tubo de microcentrífuga. Centrifugar as células não tratadas, as células tratadas e as células em água destilada a 700 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente. Transfira 200 microliters dos supernantes para cada poço de uma placa de 96 poços.
Meça a absorvância em 541 nanômetros usando um leitor de micro placas. Calcule a hemólise usando a equação onde A0, A100 e AT são a absorção de eritrócitos na solução ringer na água e a absorção de erthrócitos tratados por ionomicina. Diluir dois mililitros do buffer de ligação 5X Annexin-V em oito mililitros de PBS para obter o buffer de ligação 1X.
Resuspenque as pelotas celulares tratadas com ionomicina e não tratadas em um mililitro do buffer de ligação 1X. Pegue 235 microliters das suspensões celulares no buffer de ligação e adicione 15 microliters de anexo-V Alexa Fluor 488 conjugado em um tubo de microcentrifuuge. Incubar as células à temperatura ambiente por 20 minutos em um lugar escuro.
Centrifugar a 700 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Remova o supernatante. Lave as células duas vezes com tampão de ligação 1X suspendendo a pelota de célula em 1,5 mililitros do buffer de ligação e centrifugando a 700 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente.
Remova o supernascer e resuspenja as pelotas de célula em 250 microliters de tampão de ligação 1X para medição da citometria de fluxo. Agora transfira 200 microlitres dos eritrócitos manchados de Anexo-V para um mililitro de tubos de poliestireno redondo compatível com citometria de fluxo. Faça login no software de citometria de fluxo e clique no novo botão de experimento.
Clique no novo botão do tubo. Selecione a folha global e escolha a análise de aplicação para medir a intensidade da fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 530 nanômetros. Defina o número de células para 20.000 a serem coletadas para análise de triagem celular ativada por fluorescência.
Selecione o tubo desejado e clique no botão de carga. Clique no botão gravar para dispersão para frente e medição de dispersão lateral. Repita para todas as amostras.
Clique com o botão direito do mouse no botão da amostra e clique em aplicar análise em lote para gerar o arquivo de resultado. Clique com o botão direito do mouse no botão da amostra e clique em gerar arquivos FSC. Neste protocolo, o tratamento de eritrócitos com uma solução de ionomicina micromolar e ringer por duas horas foi suficiente para induzir a eryptose como evidenciado pela rotulagem bem sucedida com o conjugado Annexin-V Fluor 488 e quantificação pela análise FACS.
Concentrações mais elevadas de ionomicina aos cinco e 10 micromolar resultaram em um ligeiro aumento na eritpoose. No entanto, tais concentrações também aumentaram a hemólise. A incubação de eritrócitos na solução de ionomicina e Ringer por apenas 30 minutos foi suficiente para induzir eritbiose.
O aumento do tempo de incubação aumentou o nível de eritpoose por até duas horas. No entanto, um novo tempo de incubação resultou em uma ligeira diminuição no nível de eritpoose. O maior valor da hemólise após 180 minutos explica a redução da eryptose após a mesma quantidade de incubação que as células menos viáveis existiram após 180 minutos de tratamento com ionomicina.
Os eritrócitos com tratamento de ionomicina mostraram um sinal de fluorescência brilhante para a ligação de Anexo-V à serina fosfatita no folheto externo. Em contraste, as células sem tratamento apresentaram um sinal de fluorescência muito fraco indicando eritose muito baixa. A pré-incubação em um tampão sem glicose é um importante gatilho para a indução da eritose.
Uma vez que a eritpoose é observada em uma ampla gama de doenças, os experimentos que seguem este protocolo são específicos de campo. Em nosso laboratório, estamos interessados em examinar os efeitos da eritpoose nas propriedades biofísicas da membrana e interações de membrana com nanomateriais. A eritose está associada a um grande número de doenças, incluindo diabetes, anemia falciforme e talassemia.
Ter um protocolo reprodutível para induzir a eritose pode ajudar pesquisadores em qualquer um desses campos a investigar mais questões científicas específicas para cada campo.
