İonomisin kullanarak eritoz adüklemek için birçok çaba olmuştur. Ancak, bu sürecin kesin prosedürü literatürde açıkça belirtilen değildir. Biz iyonomisin kullanarak eritoz neden bir adım-adım prosedür sağlar.
Bu işlemin en büyük avantajı güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde insan eritrositlerinde eritoz neden olmaktır. Başlamak için, bir mikrosantrifüj tüp asit sitrat dekstroz soğuk tam kan 500 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 kez g tüm kan santrifüj ve kırmızı eritrosit tabakası bırakmak için bir pipet kullanarak açık plazma ve ince buffy ceket çıkarın.
125 milimolar sodyum klorür, beş milimolar potasyum klorür, bir milimolar magnezyum sülfat, 32 milimolar HEPES, beş milimolar glikoz ve bir milimolar kalsiyum klorür içeren bir litre Ringer çözeltisi hazırlayın. Bir molar sodyum hidroksit iki mikrolitre damla ekleyerek 7.4 için pH ayarlayın. Glikozsuz Ringer çözeltisi hazırlamak için aynı protokolü uygulayın, ancak çözeltiye glikoz eklemeyin.
Ringer çözeltisinde eritrositleri iki kez yıkayın hücre peletini 1,5 mililitre Ringer çözeltisinde askıya alarak, 700 kez g'de oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkartın. Daha sonra 10 mililitrelik son bir hacme ulaşmak için 9, 960 mikrolitre glikozsuz Ringer çözeltisi içinde 40 mikrolitre eritrosit peletini yeniden sulayarak %0.4 hematokrit yapın. Hücre süspansiyonuna 7 gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.
Glikozsuz bir tamponda eritrositlerin kuluçka öncesi olması eritozisi önemli ölçüde tetikler. Şekersiz tamponda yedi gün önceden kuluçkadan sonra yüksek eritofoz elde edildi. İki milimolar son konsantrasyonulaşmak için DMSO 630 mikrolitre iyonomisin kalsiyum tuzu bir miligram çözün.
Aliquot 20 mililitre ve eksi 20 santigrat derece de saklayın. Hazırlanan 0.4% hematokrit bir mililitre alın ve bir mikromolar son konsantrasyonulaşmak için iki milimolar ionomisin 0.5 mikrolitre ekleyin. 37 derecede iki saat kuluçkaya yat.
Negatif kontrol olarak hiçbir iyonomisin tedavisi ile hematokrit bir mililitre kullanın. Horomisin tedavi ve tedavi edilmemiş hematocrits oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 kez g santrifüj ve tüplerin altındaki hücre pelet bırakmak için onların supernatants kaldırın. Hücreleri Ringer çözeltisi ile üç kez yıkayın hücre peletlerini 1,5 mililitre Ringer çözeltisinde askıya alarak, 700 kez g'de oda sıcaklığında beş dakika santrifüj ederek ve süpernatantları atarak.
Hemolizi ölçmek için, bir mikrosantrifüj tüpüne bir mililitre işlenmemiş 0.4%hematokrit ekleyin ve %0 hemoliz negatif kontrolü olarak 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. %100 hemoliz pozitif kontrol hazırlamak için, bir mikrocentrifuge tüp ve santrifüj 700 kez g oda sıcaklığında beş dakika için tedavi edilmemiş% 0.4 hematokrit bir mililitre ekleyin. Supernatant çıkarın ve 37 santigrat derece iki saat boyunca yeniden askıya almak ve kuluçka hücre pelet distile su bir mililitre ekleyin.
Sonra, bir mikrosantrifüj tüp için tedavi iyonomisin bir mililitre ekleyin 0.4% hematokrit. Tedavi edilmeyen hücreleri, tedavi edilen hücreleri ve damıtılmış sudaki hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 kez g.'de santrifüj edin. 96 kuyuluk bir plakanın her kuyuya 200 mikrolitre süpernatant aktarın.
Mikro plaka okuyucu kullanarak emiciliği 541 nanometre de ölçün. A0, A100 ve AT'nin ringer çözeltisindeki eritrositlerin suda absorbe edilmesi ve tedavi edilen ertikrositlerin iyonomisin ile absorbe edilmesi denklemini kullanarak hemolizi hesaplayın. 1X bağlama tamponu elde etmek için pBS sekiz mililitre 5X Annexin-V bağlama tampon seyreltmek.
1X bağlama tamponunun bir mililitresinde iyonomisin ile tedavi edilen ve işlenmemiş hücre peletlerini yeniden askıya alın. Bağlayıcı tampon hücre süspansiyonları 235 mikrolitre alın ve bir mikrosantrifüj tüp ek15 mikrolitre Annexin-V Alexa Fluor 488 conjugate ekleyin. Hücreleri karanlık bir yerde 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 kez g santrifüj. Supernatant çıkarın. Hücre peletini 1,5 mililitre bağlayıcı arabellekte askıya alarak hücreleri 1X bağlama tamponuyla iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 kez g'de santrifüj edin.
Akış sitometrisi ölçümü için 1X bağlama tamponunun 250 mikrolitresinde süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini yeniden askıya alın. Şimdi 200 mikrolitre Annexin-V lekeli eritrositleri akış sitometrisi ile uyumlu bir mililitre yuvarlak alt polistiren tüplere aktarın. Akış sitometri yazılımına giriş yapın ve yeni deneme düğmesine tıklayın.
Yeni tüp düğmesine tıklayın. Küresel sayfayı seçin ve floresan yoğunluğunu 488 nanometre uyarma dalga boyu ve 530 nanometre emisyon dalga boyu ile ölçmek için uygulama analizini seçin. Floresan aktif hücre sıralama analizi için toplanacak hücre sayısını 20,000 olarak ayarlayın.
İstenilen tüpü seçin ve yük düğmesine tıklayın. İleri dağılım ve yan dağılım ölçümü için kayıt düğmesine tıklayın. Tüm numuneler için tekrarlayın.
Numune düğmesine sağ tıklayın ve sonuç dosyasını oluşturmak için toplu iş analizi uygula'ya tıklayın. Örnek düğmesine sağ tıklayın ve FSC dosyaları oluştur'a tıklayın. Bu protokolde, bir mikromolar iyonomisin ve Ringer çözeltisi ile eritrositlerin iki saat süreyle tedavisi, Annexin-V Fluor 488 ile başarılı etiketleme ve FACS analizi ile nicelleştirme ile kanıtlanan eritoza neden olmak için yeterli ydi.
5 ve 10 mikromolar ionomisin yüksek konsantrasyonlarda eritoz hafif bir artış ile sonuçlandı. Ancak, bu konsantrasyonlar da hemoliz gelişmiş. İonomisin ve Ringer çözeltisinde eritrositlerin 30 dakika gibi kısa bir sürede inkübasyon eritoza neden olması yeterliydi.
Artan kuluçka süresi iki saate kadar eritrosit seviyesini artırdı. Ancak, daha fazla kuluçka süresi eritrosit düzeyinde hafif bir azalmaya neden oldu. 180 dakika sonra hemoliz yüksek değeri iyonomisin ile tedavi 180 dakika sonra daha az canlı hücreler var olarak kuluçka aynı miktarda sonra eritoz azalma açıklar.
İonomisin tedavisi yapılan eritrositler, Annexin-V'nin dış broşürdeki fosfatidil serine bağlanmasıiçin parlak floresan sinyali gösterdi. Buna karşılık, tedavisi olmayan hücreler çok düşük eritme olduğunu gösteren çok zayıf floresan sinyali gösterdiler. Glikozsuz bir tamponda kuluçka öncesi eritmetozin indüksiyonu için önemli bir tetikleyicidir.
Eritrosit çok çeşitli hastalıklarda görüldüğünden, bu protokolü takip eden deneyler alana özgüdür. Laboratuvarımızda, eritrositin membran biyofiziksel özellikleri ve nanomalzemelerle membran etkileşimleri üzerindeki etkilerini incelemek istiyoruz. Eritrosit diyabet, orak hücreli anemi ve talasemi gibi hastalıkların çok sayıda ile ilişkilidir.
Eritoz unneden tekrarlanabilir bir protokole sahip olmak, bu alanlardaki araştırmacıların her alana özgü daha fazla bilimsel soruyu araştırmalarına yardımcı olabilir.
