Ha habido muchos esfuerzos para inducir la eriptosis usando ionomicina. Sin embargo, el procedimiento exacto para este proceso no se describe claramente en la literatura. Proporcionamos un procedimiento paso a paso para inducir la eriptosis usando ionomicina.
La principal ventaja de este procedimiento es inducir la eriptosis en eritrocitos humanos de una manera confiable y reproducible. Para comenzar, agregue 500 microlitros de sangre entera fría en citrato ácido dextrosa a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar toda la sangre a 700 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retire el plasma transparente y la capa fina con una pipeta para salir de la capa roja de eritrocitos.
Preparar un litro de solución Ringer que contenga 125 mililitros de cloruro de sodio, cloruro de potasio de cinco milimolares, un sulfato de magnesio milimolar, 32 HEPES milimétricas, glucosa de cinco mililitrolares y un cloruro de calcio milimiolar. Ajuste el pH a 7.4 añadiendo dos gotas de microlitro de un hidróxido de sodio molar. Para preparar la solución Ringer libre de glucosa, siga el mismo protocolo, pero no incluya glucosa en la solución.
Lavar los eritrocitos dos veces en solución Ringer suspendiendo el pellet celular en 1,5 mililitros de solución Ringer, centrifugando a 700 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente y eliminando el sobrenadante. A continuación, haga un 0,4%hematocrito resuspender 40 microlitros del pellet de eritrocitos en 9, 960 microlitros de solución Ringer libre de glucosa para alcanzar un volumen final de 10 mililitros. Incubar la suspensión celular a 37 grados centígrados durante siete días.
La pre-incubación de eritrocitos en un tampón libre de glucosa desencadena significativamente la eriptosis. Se obtuvo una eritrtosis alta después de siete días de pre-incubación en el tampón sin azúcar. Disolver un miligramo de sal de calcio ionomicina en 630 microlitros de DMSO para alcanzar una concentración final de dos mililitros.
Aliquot en 20 mililitros y almacenar a menos 20 grados Celsius. Tome un mililitro del hematocrito preparado al 0,4% y añada 0,5 microlitros de dos ionomicinas milimétricas para alcanzar una concentración final de un micromolar. Incubar durante dos horas a 37 grados centígrados.
Utilice un mililitro del hematocrito sin tratamiento con ionomicina como control negativo. Centrifugar la ionomicina tratada y los hematocritos no tratados a 700 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar sus sobrenadantes para dejar los gránulos celulares en la parte inferior de los tubos. Lavar las células tres veces con la solución Ringer suspendiendo los pellets celulares en 1,5 mililitros de solución Ringer, centrifugando a 700 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente y descartando los sobrenadantes.
Para medir la hemólisis, agregue un mililitro del 0,4% de hematocrito no tratado a un tubo de microcentrífuga e incubar durante dos horas a 37 grados centígrados como control negativo de 0%hemólisis. Para preparar el control positivo de 100% hemólisis, añadir un mililitro del 0,4% de hematocrito sin tratar a un tubo de microcentrífuga y centrífuga a 700 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y agregue un mililitro de agua destilada al pellet celular para resuspend e incubar durante dos horas a 37 grados centígrados.
A continuación, añada un mililitro de la ionomicina tratada 0,4% de hematocrito a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar las células no tratadas, las células tratadas y las células en agua destilada a 700 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Transfiera 200 microlitros de los sobrenadantes a cada pozo de una placa de 96 pozos.
Mida la absorbancia a 541 nanómetros utilizando un lector de microplamas. Calcular la hemólisis utilizando la ecuación donde A0, A100, y AT son la absorbancia de eritrocitos en ringer solución en agua y la absorción de ertirocitos tratados por ionomicina. Diluir dos mililitros del búfer de unión Annexin-V 5X en ocho mililitros de PBS para obtener un búfer de unión 1X.
Resuspender los gránulos celulares tratados con ionomicina y sin tratar en un mililitro del tampón de unión 1X. Tome 235 microlitros de las suspensiones celulares en el tampón de unión y agregue 15 microlitros del conjugado Desamparados Alexa Fluor 488 de Annexin-V en un tubo de microcentrífuga. Incubar las células a temperatura ambiente durante 20 minutos en un lugar oscuro.
Centrifugar a 700 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante. Lave las células dos veces con un tampón de unión 1X suspendiendo el pellet celular en 1,5 mililitros del tampón de unión y centrifugando a 700 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Retire el sobrenadante y resusppend los gránulos celulares en 250 microlitros de tampón de unión 1X para la medición de la citometría de flujo. Ahora transfiera 200 microlitros de los eritrocitos manchados Annexin-V a tubos de poliestireno inferior redondos de un mililitro compatible con la citometría de flujo. Inicie sesión en el software de citometría de flujo y haga clic en el botón del nuevo experimento.
Haga clic en el nuevo botón de tubo. Seleccione la hoja global y elija el análisis de aplicación para medir la intensidad de la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 530 nanómetros. Establezca el número de celdas en 20.000 que se recopilarán para el análisis de clasificación de celdas activadas por fluorescencia.
Seleccione el tubo deseado y haga clic en el botón de carga. Haga clic en el botón de grabación para la dispersión hacia delante y la medición de dispersión lateral. Repita el proceso para todas las muestras.
Haga clic con el botón derecho en el botón de muestra y haga clic en Aplicar análisis por lotes para generar el archivo de resultados. Haga clic derecho en el botón de muestra y haga clic en generar archivos FSC. En este protocolo, el tratamiento de eritrocitos con una solución de ionesomicina micromolar y Ringer durante dos horas fue suficiente para inducir la eriptosis como se evidenció mediante el etiquetado exitoso con el conjugado y cuantificación del Fluor 488 de Annexin-V 488 mediante el análisis FACS.
Las concentraciones más altas de ionomicina a cinco y 10 micromolares dieron lugar a un ligero aumento de la eriptosis. Sin embargo, tales concentraciones también mejoraron la hemólisis. La incubación de eritrocitos en ionomicina y solución de Ringer durante tan solo 30 minutos fue suficiente para inducir la eriptosis.
El aumento del tiempo de incubación aumentó el nivel de eriptosis hasta por dos horas. Sin embargo, el tiempo de incubación posterior dio lugar a una ligera disminución en el nivel de eriptosis. El mayor valor de la hemólisis después de 180 minutos explica la reducción de la eriptosis después de la misma cantidad de incubación que las células menos viables existieron en 180 minutos de tratamiento con ionomicina.
Los eritrocitos con tratamiento con ionomicina mostraron una señal de fluorescencia brillante a la unión de Annexin-V al fosfatidil serina en el prospecto exterior. Por el contrario, las células sin tratamiento mostraron una señal de fluorescencia muy débil que indicaba una eructosis muy baja. La pre-incubación en un tampón libre de glucosa es un desencadenante importante para la inducción de la eriptosis.
Dado que la eriptosis se observa en una amplia gama de enfermedades, los experimentos que siguen este protocolo son específicos del campo. En nuestro laboratorio, estamos interesados en examinar los efectos de la eriptosis en las propiedades biofísicas de membrana e interacciones de membrana con nanomateriales. La eritrtosis se asocia con un gran número de enfermedades, como diabetes, anemia de células falciformes y talasemia.
Tener un protocolo reproducible para inducir la eriptosis puede ayudar a los investigadores en cualquiera de estos campos a investigar más preguntas científicas específicas de cada campo.
