Ci sono stati molti sforzi per indurre l'erioptosi usando la ionomicina. Tuttavia, la procedura esatta per questo processo non è chiaramente delineata nella letteratura. Forniamo una procedura passo-passo per indurre l'erioptosi usando l'ionomicina.
Il principale vantaggio di questa procedura è quello di indurre l'erioptosi negli eriociti umani in modo affidabile e riproducibile. Per iniziare, aggiungere 500 microlitri di sangue intero freddo in destrosio citrato acido a un tubo di microcentrifugo. Centrifugare il sangue intero a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il plasma chiaro e il sottile mantello di buffy usando una pipetta per lasciare lo strato di eriocite rosso.
Preparare un litro di soluzione ringer contenente 125 cloruro di sodio millimolare, cinque cloruri millimolare di potassio, un solfato di magnesio millimolare, 32 HEPES millimolare, cinque millimolare di glucosio e un cloruro di calcio millimolare. Regolare il pH a 7,4 aggiungendo due gocce di microlitero di un idrossido di sodio molare. Per preparare la soluzione Ringer senza glucosio, seguire lo stesso protocollo ma non includere il glucosio nella soluzione.
Lavare gli erytrociti due volte in soluzione Ringer sospendendo il pellet cellulare in 1,5 millilitri di soluzione Ringer, centrifugando a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovendo il supernatante. Quindi fare uno 0,4% di ematocrito rimescolando 40 microlitri del pellet di eritemo in 9.960 microlitri di soluzione Ringer senza glucosio per raggiungere un volume finale di 10 millilitri. Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius per sette giorni.
La pre-incubazione di eriociti in un tampone privo di glucosio innesca significativamente l'erettidosi. L'alta erettidosi è stata ottenuta dopo sette giorni di pre-incubazione nel tampone senza zucchero. Sciogliere un milligrammo di sale di calcio di ionomicina in 630 microlitri di DMSO per raggiungere una concentrazione finale di due millimolari.
Aliquota in 20 millilitri e conservare a meno 20 gradi Celsius. Prendere un millilitro dello 0,4% di ematocrito preparato e aggiungere 0,5 microlitri di due ionomicina millimolare per raggiungere una concentrazione finale di un micromolare. Incubare per due ore a 37 gradi Celsius.
Utilizzare un millilitro dell'ematocrito senza trattamento con ionomicina come controllo negativo. Centrifugare gli ematocriti trattati con ionomicina e non trattati a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere i loro supernaganti per lasciare i pellet cellulari nella parte inferiore dei tubi. Lavare le celle tre volte con soluzione Ringer sospendendo i pellet cellulari in 1,5 millilitri di soluzione Ringer, centrifugando a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente e scartando i supernatanti.
Per misurare l'emolisi, aggiungere un millilitro dell'ematocrito non trattato allo 0,4% a un tubo di microcentrifugo e incubare per due ore a 37 gradi Celsius come controllo negativo dello 0%emolisi. Per preparare il controllo positivo dell'emolisi al 100%, aggiungere un millilitro dell'ematocrito non trattato allo 0,4% a un tubo di microcentrifugo e centrifugare a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e aggiungere un millilitro di acqua distillata al pellet cellulare per rimescolare e incubare per due ore a 37 gradi Celsius.
Aggiungere quindi un millilitro della ionomicina trattata con 0,4% di ematocrito a un tubo di microcentrifugo. Centrifugare le cellule non trattate, le cellule trattate e le cellule in acqua distillata a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Trasferire 200 microlitri dei supernatanti in ogni pozzo di una piastra da 96 porri.
Misurare l'assorbanza a 541 nanometri utilizzando un lettore di micro lastre. Calcola l'emolisi usando l'equazione in cui A0, A100 e AT sono l'assorbanza degli eriociti nella soluzione di Ringer in acqua e l'assorbanza degli erthyrociti trattati dalla ionomicina. Diluire due millilitri del tampone di legame 5X Annexin-V in otto millilitri di PBS per ottenere un buffer di legame 1X.
Rimossare il pellet di cellule trattate con ionomicina e non trattate in un millilitro del tampone di legame 1X. Prendere 235 microlitri delle sospensioni cellulari nel tampone di legame e aggiungere 15 microlitri di annesso-V Alexa Fluor 488 coniugati in un tubo di microcentrifugo. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti in un luogo buio.
Centrifugare a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante. Lavare le celle due volte con tampone legante 1X sospendendo il pellet cellulare in 1,5 millilitri del tampone di legame e centrifugando a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 250 microlitri di tampone legante 1X per la misurazione della citometria del flusso. Ora trasferisci 200 microlitri degli erytrociti macchiati Annexin-V in un tubi di polistirolo rotondo inferiore millilitro compatibili con la citometria a flusso. Accedere al software di citometria a flusso e fare clic sul nuovo pulsante esperimento.
Clicca sul nuovo pulsante del tubo. Selezionare il foglio globale e scegliere l'analisi di applicazione per misurare l'intensità della fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nanometri. Impostare il numero di celle su 20.000 da raccogliere per l'analisi di smistamento delle celle attivata a fluorescenza.
Selezionare il tubo desiderato e fare clic sul pulsante di caricamento. Fare clic sul pulsante di registrazione per la misurazione della dispersione in avanti e della dispersione laterale. Ripetere l'audio per tutti i campioni.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante del campione e scegliere applica analisi batch per generare il file dei risultati. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante campione e fare clic su genera file FSC. In questo protocollo, il trattamento degli eriociti con una soluzione di ionomicina micromolare e suoneria per due ore è stato sufficiente a indurre l'erioptosi, come evidenziato da un'etichettatura riuscita con coniugato Annexin-V Fluor 488 e quantificazione mediante analisi FACS.
Concentrazioni più elevate di ionomicina a cinque e 10 micromolari hanno provocato un leggero aumento dell'erettidosi. Tuttavia, tali concentrazioni hanno anche migliorato l'emolisi. L'incubazione di erytrociti in soluzione di ionomicina e suoneria per soli 30 minuti è stata sufficiente a indurre l'erioptosi.
L'aumento del tempo di incubazione ha aumentato il livello di erettidosi per un massimo di due ore. Tuttavia, un ulteriore tempo di incubazione ha portato a una leggera diminuzione del livello di erettidosi. Il valore più elevato dell'emolisi dopo 180 minuti spiega la riduzione dell'erioptosi dopo la stessa quantità di incubazione delle cellule meno vitali esistevano dopo 180 minuti di trattamento con ionomicina.
Gli eriociti con trattamento con ionomicina hanno mostrato un segnale di fluorescenza brillante al legame dell'annesso-V alla fosfatidil serina nel foglio illustrativo esterno. Al contrario, le cellule senza trattamento hanno mostrato un segnale di fluorescenza molto debole che indica un'erettidosi molto bassa. La pre-incubazione in un tampone privo di glucosio è un fattore scatenante importante per l'induzione dell'erettidosi.
Poiché l'erioptosi è osservata in una vasta gamma di malattie, gli esperimenti che seguono questo protocollo sono specifici sul campo. Nel nostro laboratorio, siamo interessati ad esaminare gli effetti dell'erioptosi sulle proprietà biofisiche della membrana e sulle interazioni di membrana con i nanomateriali. L'erioptosi è associata a un gran numero di malattie tra cui diabete, anemia falciforme e talassemia.
Avere un protocollo riproducibile per indurre l'erioptosi può aiutare i ricercatori in uno di questi campi a indagare ulteriori questioni scientifiche specifiche per ogni campo.
