Es gab viele Bemühungen, Eryptose mit Ionomycin zu induzieren. Das genaue Verfahren für diesen Prozess ist jedoch in der Literatur nicht klar umrissen. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Verfahren, um Eryptose mit Ionomycin zu induzieren.
Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, Eryptose bei menschlichen Erythrozyten auf zuverlässige und reproduzierbare Weise zu induzieren. Zu Beginn 500 Mikroliter kaltes Vollblut in Säurecitrat-Dextrose in ein Mikrozentrifugenrohr geben. Zentrifugieren Sie das Ganze bei 700 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie das klare Plasma und das dünne, buffy Mantel mit einer Pipette, um die rote Erythrozytenschicht zu verlassen.
Bereiten Sie einen Liter Ringer-Lösung mit 125 Millimolaren-Natriumchlorid, fünf Millimolaren-Kaliumchlorid, einem Millimolaren-Magnesiumsulfat, 32 Millimolaren-HEPES, fünf Millimolaren Glukose und einem Millimolaren Calciumchlorid vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie zwei Mikrolitertropfen eines Mol-Natriumhydroxids hinzufügen. Um glukosefreie Ringer-Lösung vorzubereiten, folgen Sie dem gleichen Protokoll, aber enthalten Sie keine Glukose in der Lösung.
Waschen Sie die Erythrozyten zweimal in Ringer-Lösung, indem Sie das Zellpellet in 1,5 Milliliter Ringer-Lösung aufhängen, bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugieren und den Überstand entfernen. Dann machen Sie eine 0,4%hämatocrit durch Die Aussetzung 40 Mikroliter des Erythrozytenpellets in 9, 960 Mikroliter glukosefreie Ringer-Lösung, um ein endgültiges Volumen von 10 Milliliter zu erreichen. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 Grad Celsius für sieben Tage.
Die Vorinkubation von Erythrozyten in einem glukosefreien Puffer löst signifikant Eryptose aus. Eine hohe Eryptose wurde nach sieben Tagen Vorinkubation im zuckerfreien Puffer erreicht. Lösen Sie ein Milligramm Ionomycin-Calciumsalz in 630 Mikroliter DMSO auf, um eine Endkonzentration von zwei Millimolar zu erreichen.
Aliquot in 20 Milliliter und lagern bei minus 20 Grad Celsius. Nehmen Sie einen Milliliter des vorbereiteten 0,4%Hämatokrit und fügen Sie 0,5 Mikroliter von zwei Millimolar-Ionomycin hinzu, um eine endgültige Konzentration von einem Mikromolar zu erreichen. Zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Verwenden Sie einen Milliliter des Hämatokrits ohne Ionomycin-Behandlung als Negativkontrolle. Zentrifugieren Sie die mit Ionomycin behandelten und unbehandelten Hämatokriten bei 700 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie ihre Überwälstmittel, um die Zellpellets am Boden der Rohre zu verlassen. Waschen Sie die Zellen dreimal mit Ringer-Lösung, indem Sie die Zellpellets in 1,5 Milliliter Ringer-Lösung aufhängen, bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugieren und die Überblässen entsorgen.
Um die Hämolyse zu messen, fügen Sie einen Milliliter des unbehandelten 0,4%Hämatokrits in ein Mikrozentrifugenrohr und brüten zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius als Negativkontrolle von 0%Hämolyse. Um die positive Kontrolle der 100%hämolyse vorzubereiten, fügen Sie einen Milliliter des unbehandelten 0,4%Hämatokrits bei 700-fachem g bei Raumtemperatur in ein Mikrozentrifugenrohr und eine Zentrifuge ein. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet einen Milliliter destilliertes Wasser hinzu, um es wieder aufzuhängen und zwei Stunden bei 37 Grad Celsius zu brüten.
Als nächstes fügen Sie einem Mikrozentrifugenröhrchen einen Milliliter des behandelten Ionomycins 0,4% Hämatokrit hinzu. Zentrifugieren Sie die unbehandelten Zellen, behandelten Zellen und die Zellen in destilliertem Wasser bei 700-fachem g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. 200 Mikroliter der Überräube in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte übertragen.
Messen Sie die Absorption mit 541 Nanometern mit einem Mikroplattenleser. Berechnen Sie die Hämolyse mit der Gleichung, wobei A0, A100 und AT die Absorption von Erythrozyten in Ringer-Lösung in Wasser und die Absorption von behandelten Erthyrozyten durch Ionomycin sind. Verdünnen Sie zwei Milliliter des 5X Annexin-V Bindungspuffers in acht Milliliter PBS, um einen 1X Bindungspuffer zu erhalten.
Setzen Sie die mit Ionomycin behandelten und unbehandelten Zellpellets in einem Milliliter des 1X Bindungspuffers aus. Nehmen Sie 235 Mikroliter der Zellsuspensionen im Bindungspuffer und fügen Sie 15 Mikroliter Annexin-V Alexa Fluor 488 Konjugat in einem Mikrozentrifugenrohr hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 20 Minuten an einem dunklen Ort.
Zentrifuge bei 700 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1X Bindungspuffer, indem Sie das Zellpellet in 1,5 Milliliter des Bindungspuffers aufhängen und bei 700-fachem g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellpellets in 250 Mikroliter 1X Bindungspuffer für die Durchflusszytometriemessung wieder auf. Nun 200 Mikroliter der annein-V gebeizten Erythrozyten in einen Milliliter runde Unterteil-Polystyrolröhren übertragen, die mit der Durchflusszytometrie kompatibel sind. Melden Sie sich bei der Flow-Zytometrie-Software an und klicken Sie auf die neue Experimentschaltfläche.
Klicken Sie auf die neue Tube-Taste. Wählen Sie das globale Blatt aus, und wählen Sie die Anwendungsanalyse aus, um die Fluoreszenzintensität mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 530 Nanometern zu messen. Legen Sie die Anzahl der Zellen auf 20 000 fest, die für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse gesammelt werden sollen.
Wählen Sie das gewünschte Rohr und klicken Sie auf den Ladeknopf. Klicken Sie auf die Aufnahmetaste für die Messung der Vorwärtsstreuung und der Seitenstreuung. Wiederholen Sie dies für alle Proben.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Muster-Button und klicken Sie auf Chargenanalyse anwenden, um die Ergebnisdatei zu generieren. Rechtsklick auf Muster-Button und klicken Sie auf FSC-Dateien generieren. In diesem Protokoll reichte die Behandlung von Erythrozyten mit einer Mikromolar-Ionomycin- und Ringer-Lösung für zwei Stunden aus, um Eine Eryptose auszulösen, wie eine erfolgreiche Kennzeichnung mit Annexin-V Fluor 488-Konjugat und Quantifizierung durch FACS-Analyse belegt.
Höhere Konzentrationen von Ionomycin bei fünf und zehn Mikromolaren führten zu einem leichten Anstieg der Eryptose. Solche Konzentrationen verstärkten jedoch auch die Hämolyse. Die Inkubation von Erythrozyten in Ionomycin und Ringer-Lösung für nur 30 Minuten reichte aus, um Eryptose zu induzieren.
Erhöhte Inkubationszeit erhöhte das Niveau der Eryptose für bis zu zwei Stunden. Eine weitere Inkubationszeit führte jedoch zu einem leichten Rückgang des Eryptosespiegels. Der höhere Wert der Hämolyse nach 180 Minuten erklärt die Reduktion der Eryptose nach der gleichen Menge an Inkubation wie weniger lebensfähige Zellen nach 180 Minuten Behandlung mit Ionomycin existierten.
Erythrozyten mit Ionomycin-Behandlung zeigten ein helles Fluoreszenzsignal an die Bindung von Annexin-V an Phosphatidylserin in der äußeren Packungsbeilage. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen ohne Behandlung ein sehr schwaches Fluoreszenzsignal, das auf eine sehr geringe Eryptose hindeutet. Die Vorinkubation in einem glukosefreien Puffer ist ein wichtiger Auslöser für die Induktion der Eryptose.
Da Eryptose bei einer Vielzahl von Krankheiten beobachtet wird, sind die Experimente nach diesem Protokoll feldspezifisch. In unserem Labor sind wir daran interessiert, die Auswirkungen der Eryptose auf die biophysikalischen Eigenschaften der Membran und die Wechselwirkungen mit Nanomaterialien zu untersuchen. Eryptose ist mit einer großen Anzahl von Krankheiten wie Diabetes, Sichelzellanämie und Thalassämie verbunden.
Ein reproduzierbares Protokoll zur Induktion von Eryptose kann Forschern in jedem dieser Bereiche helfen, weitere wissenschaftliche Fragen zu untersuchen, die für jedes Gebiet spezifisch sind.
