Il y a eu beaucoup d’efforts pour induire l’éryptose utilisant l’ionomycine. Toutefois, la procédure exacte de ce processus n’est pas clairement décrite dans la littérature. Nous fournissons une procédure étape par étape pour induire l’éryptose utilisant l’ionomycine.
Le principal avantage de cette procédure est d’induire l’éryptose chez les érythrocytes humains d’une manière fiable et reproductible. Pour commencer, ajouter 500 microlitres de sang entier froid dans le dextrose de citrate acide à un tube de microcentrifugeuse. Centrifuger le sang entier à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante et enlever le plasma clair et la fine couche buffy à l’aide d’une pipette pour laisser la couche d’érythrocyte rouge.
Préparez un litre de solution Ringer contenant du chlorure de sodium de 125 millimlaires, du chlorure de potassium millimolaire, un sulfate de magnésium millimolaire, 32 millimolaires hepes, cinq millimolaires de glucose et un chlorure de calcium millimolaire. Réglez le pH à 7,4 en ajoutant deux gouttes de microlitre d’un hydroxyde de sodium molaire. Pour préparer la solution Ringer sans glucose, suivez le même protocole mais n’incluez pas le glucose dans la solution.
Lavez les érythrocytes deux fois dans la solution Ringer en suspendant la pastille cellulaire dans 1,5 millilitres de solution Ringer, en centrifugant à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante et en enlevant le supernatant. Ensuite, faire un hematocrit de 0,4% en résustant 40 microlitres de la pastille érythrocyte en 9,960 microlitres de solution Ringer sans glucose pour atteindre un volume final de 10 millilitres. Incuber la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius pendant sept jours.
La pré-incubation des érythrocytes dans un tampon sans glucose déclenche considérablement l’éryptose. L’éryptose élevée a été obtenue après sept jours de pré-incubation dans le tampon sans sucre. Dissoudre un milligramme de sel de calcium ionomycine dans 630 microlitres de DMSO pour atteindre une concentration finale de deux millimolaires.
Aliquot en 20 millilitres et stocker à moins 20 degrés Celsius. Prenez un millilitre de l’hématocrit préparé de 0,4% et ajoutez 0,5 microlitres de deux ionomycine millimolaire pour atteindre une concentration finale d’un micromolaire. Incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius.
Utilisez un millilitre de l’hématocrit sans traitement à l’ionomycine comme un contrôle négatif. Centrifugeuse l’ionomycine traitée et non traitée hématocrits à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante et enlever leurs supernatants pour laisser les granulés cellulaires au fond des tubes. Lavez les cellules trois fois avec la solution Ringer en suspendant les granulés cellulaires dans 1,5 millilitres de solution Ringer, en centrifugant à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante et en jetant les supernatants.
Pour mesurer l’hémolyse, ajouter un millilitre de l’hématocrit non traité de 0,4 % à un tube de microcentrifugeuse et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius comme le contrôle négatif de l’hémolyse de 0 %. Pour préparer le contrôle positif de l’hémolyse à 100 %, ajoutez un millilitre de l’hématocrit non traité de 0,4 % à un tube de microcentrifugeuse et à une centrifugeuse à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirer le supernatant et ajouter un millilitre d’eau distillée à la pastille cellulaire pour la résuspendre et l’incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius.
Ensuite, ajouter un millilitre de l’ionomycine traitée 0,4% hématocrit à un tube de microcentrifugeuse. Centrifugez les cellules non traitées, les cellules traitées et les cellules dans l’eau distillée à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Transférer 200 microlitres des supernatants dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.
Mesurez l’absorption à 541 nanomètres à l’aide d’un lecteur de micro plaque. Calculer l’hémolyse à l’aide de l’équation où A0, A100 et AT sont l’absorption des érythrocytes dans la solution Ringer dans l’eau et l’absorption des erthyrocytes traités par l’ionomycine. Diluer deux millilitres du tampon de liaison 5X Annexin-V en huit millilitres de PBS pour obtenir un tampon de liaison 1X.
Resuspendez les granulés cellulaires traités à l’ionomycine et non traités en un millilitre du tampon de liaison 1X. Prendre 235 microlitres des suspensions cellulaires dans le tampon de liaison et ajouter 15 microlitres d’Annexin-V Alexa Fluor 488 conjuguer dans un tube de microcentrifugeuse. Incuber les cellules à température ambiante pendant 20 minutes dans un endroit sombre.
Centrifugeuse à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirer le surnatant. Lavez les cellules deux fois avec un tampon liant 1X en suspendant la pastille cellulaire dans 1,5 millilitres du tampon liant et en centrifugant à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.
Enlevez le supernatant et resuspendez les granulés cellulaires dans 250 microlitres de tampon de liaison 1X pour la mesure de cytométrie d’écoulement. Transférez maintenant 200 microlitres des érythrocytes tachés Annexin-V à des tubes de polystyrène ronds d’un millilitre compatibles avec la cytométrie du débit. Connectez-vous au logiciel de cytométrie de flux et cliquez sur le nouveau bouton d’expérience.
Cliquez sur le nouveau bouton tube. Sélectionnez la feuille globale et choisissez l’analyse d’application pour mesurer l’intensité de fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 530 nanomètres. Réglez le nombre de cellules à 20 000 à recueillir pour l’analyse du tri cellulaire activé par fluorescence.
Sélectionnez le tube désiré et cliquez sur le bouton de charge. Cliquez sur le bouton enregistrer pour la diffusion vers l’avant et la mesure de dispersion latérale. Répéter pour tous les échantillons.
Cliquez à droite sur le bouton spécimen et cliquez sur appliquer l’analyse des lots pour générer le fichier de résultats. Cliquez à droite sur le bouton spécimen et cliquez sur générer des fichiers FSC. Dans ce protocole, le traitement des érythrocytes avec une solution micromolar d’ionomycine et de ringer pendant deux heures était suffisant pour induire l’éryptose comme démontré par l’étiquetage réussi avec annexin-V Fluor 488 conjugué et quantification par analyse d’FACS.
Des concentrations plus élevées d’ionomycine à cinq et 10 micromolaires ont entraîné une légère augmentation de l’éryptose. Cependant, de telles concentrations ont également augmenté l’hémolyse. L’incubation des érythrocytes dans la solution d’ionomycine et de Ringer pendant aussi peu que 30 minutes était suffisante pour induire l’éryptose.
L’augmentation du temps d’incubation a augmenté le niveau d’éryptose jusqu’à deux heures. Cependant, le temps d’incubation supplémentaire a eu comme conséquence une légère diminution du niveau d’éryptose. La valeur plus élevée de l’hémolyse après 180 minutes explique la réduction de l’éryptose après la même quantité d’incubation que les cellules moins viables existaient sur 180 minutes de traitement par ionomycine.
Les érythrocytes avec le traitement d’ionomycine ont montré un signal lumineux de fluorescence à la liaison d’Annexin-V à la sérine de phosphatidyl dans le foliole externe. En revanche, les cellules sans traitement ont montré un signal de fluorescence très faible indiquant l’éryptose très basse. La pré-incubation dans un tampon sans glucose est un déclencheur important de l’induction de l’éryptose.
Puisque l’éryptose est observée dans un large éventail de maladies, les expériences suivant ce protocole sont spécifiques au domaine. Dans notre laboratoire, nous sommes intéressés à examiner les effets de l’éryptose sur les propriétés biophysiques membranaires et les interactions membranaires avec les nanomatériaux. L’éryptose est associée à un grand nombre de maladies, y compris le diabète, l’anémie falciforme et la thalassémie.
Avoir un protocole reproductible pour induire l’éryptose peut aider les chercheurs dans l’un de ces domaines à étudier d’autres questions scientifiques spécifiques à chaque domaine.
