ヨノマイシンを用いた紅斑症を誘導する努力が数多く行われている。しかし、このプロセスの正確な手順は、文献で明確に概説されていません。イオノマイシンを用いた紅斑症を誘導するステップバイステップの手順を提供します。
この手順の主な利点は、信頼性の高い、再現性のある方法でヒト赤血球の赤紅斑を誘導することです。まず、酸クエン酸デキストロースに500マイクロリットルの冷たい全血をマイクロ遠心分離チューブに加えます。全血を室温で5分間5分間、700倍gで遠心分離し、透明な血漿と薄いバフィーコートをピペットを使用して赤い赤血球層を残します。
125ミリモル塩化ナトリウム、5ミリモル塩化カリウム、1ミリモル硫酸マグネシウム、32ミリモルHEPES、5ミリモルグルコース、1ミリモルクロリドカルシウムを含むリンガー溶液の1リットルを調製します。1モル水酸化ナトリウムの2マイクロリットル滴を加えて、pHを7.4に調整します。グルコースフリーリンジャー溶液を調製するには、同じプロトコルに従いますが、溶液中にグルコースを含まないでください。
細胞ペレットをリンガー溶液の1.5ミリリットルに懸濁し、室温で5分間700倍gで遠心し、上清を取り除くことによって、リンガー溶液で赤血球を2回洗浄します。その後、9,960マイクロリットルのグルコースフリーリンジャー溶液で40マイクロリットルの赤血球ペレットを再懸濁して0.4%ヘマトクリットを作り、10ミリリットルの最終体積に達する。細胞懸濁液を摂氏37度で7日間インキュベートする。
グルコースフリーバッファー内の赤血球の前培養は、エリスプトーゼを著しく誘発する。高いエリプトシスは、無糖緩衝液中の7日間の前培養後に得られた。630マイクロリットルのDMSOにヨノマイシンカルシウム塩の1ミリグラムを溶解し、2ミリモルの最終濃度に達する。
20ミリリットルのアリコートとマイナス20度で保存します。調製した0.4%ヘマトクリットの1ミリリットルを取り、1マイクロモルの最終濃度に達するために2ミリモルイオノマイシンの0.5マイクロリットルを追加します。摂氏37度で2時間インキュベートします。
ヨノマイシン処理を行っていないヘマトクリットを1ミリリットルの陰性対照として使用する。ヨノマイシンを処理し、未処理のヘマトクリットを室温で5分間5分間処理し、その上清を取り除いて細胞ペレットをチューブの底に残します。リンガー溶液の1.5ミリリットルに細胞ペレットを懸濁し、室温で5分間700倍gで遠心し、上清を捨てて、リンガー溶液で細胞を3回洗浄します。
融解を測定するには、未処理の0.4%ヘマトクリットをマイクロ遠心管に1ミリリットル加え、0%ヘモリシスの陰性対照として摂氏37度で2時間インキュベートする。100%の正のコントロールを調製するために、未処理の0.4%ヘマトクリットの1ミリリットルをマイクロ遠心分離管に加え、遠心分離機を室温で5分間700倍にします。上清を取り除き、蒸留水1ミリリットルを細胞ペレットに加えて再懸濁し、摂氏37度で2時間インキュベートします。
次に、0.4%ヘマトクリット処理したヨノマイシンをマイクロ遠心チューブに1ミリリットル加える。未処理の細胞を遠心分離し、細胞を処理し、蒸留水中の細胞を室温で5分間700回gで処理した。上清の200マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに移します。
マイクロプレートリーダーを使用して、541ナノメートルで吸光度を測定します。A0、A100、ATが水中のリンジャー溶液中の赤血球の吸光度と、ヨノマイシンによる処理されたエルチロサイトの吸光度である式を用いて溶血を計算します。PBSの8ミリリットルで5XアネキシンV結合バッファーの2ミリリットルを希釈し、1X結合バッファーを得る。
1X結合バッファーの1ミリリットルでヨノマイシン処理および未処理の細胞ペレットを再懸濁します。結合バッファー内の細胞懸濁液の 235 マイクロリットルを取り、マイクロ遠心チューブにアネキシン V アレクサフルーオール 488 コンジュゲートの 15 マイクロリットルを追加します。暗い場所で20分間室温で細胞をインキュベートします。
室温で5分間700回gで遠心分離機。上清を取り除く。細胞ペレットを結合バッファーの 1.5 ミリリットルにサスペンドし、遠心分離機を 700 回 g で室温で 5 分間にして、1X 結合バッファーで 2 回洗浄します。
上清を取り除き、フローサイトメトリー測定のために1X結合バッファの250マイクロリットルの細胞ペレットを再懸濁します。今、アネキシン-V染色赤血球の200マイクロリットルをフローサイトメトリーと互換性のある1ミリリットルの丸い底ポリスチレンチューブに移します。フローサイトメトリーソフトウェアにログインし、新しい実験ボタンをクリックします。
新しいチューブボタンをクリックします。グローバルシートを選択し、488ナノメートルの励起波長と530ナノメートルの発光波長で蛍光強度を測定する適用分析を選択します。蛍光活性化細胞選別分析のために収集する細胞数を20,000に設定する。
目的のチューブを選択し、ロードボタンをクリックします。前方散乱および側面散乱測定のための記録ボタンをクリックします。すべてのサンプルに対して繰り返します。
検体ボタンを右クリックし、バッチ分析の適用をクリックして結果ファイルを生成します。標本ボタンを右クリックし、FSCファイルを生成をクリックします。このプロトコルでは、1つのマイクロモルイオノマイシンおよびリンガー溶液を用いた赤血球の治療は、FACS分析によるアネキシン-V Fluor 488コンジュゲートおよび定量化に成功した標識によって証明されるように、エリプトーゼを誘導するのに十分であった。
5および10マイクロモルでのヨノマイシンの濃度が高いほど、紅斑症がわずかに増加した。しかし、このような濃度もまた、凝行を増強した。ヨノマイシンおよびリンガー溶液中の赤血球のインキュベーションは、わずか30分間、紅斑症を誘発するのに十分であった。
インキュベーション時間の増加は、最大2時間の紅斑のレベルを増加させた。しかし、さらにインキュベーション時間は、紅斑症のレベルのわずかな減少をもたらした。180分後の血化の高い値は、ヨノマイシンによる処理の180分で存在した生存細胞と同じ量の培養後の紅斑症の減少を説明する。
ヨノマイシン治療を伴う赤血球は、アウターリーフレットにおけるホスファチジルセリンへのアネキシン-Vの結合に対する明るい蛍光シグナルを示した。対照的に、治療を行っていない細胞は、非常に低いエリプト症を示す非常に弱い蛍光シグナルを示した。グルコースフリーバッファーでのプレインキュベーションは、紅斑症の誘導のための重要なトリガーです。
広範囲の疾患でエリプト症が観察されるため、このプロトコルに従う実験はフィールド固有である。研究室では、赤血球症が膜の生体物理特性やナノ材料との膜相互作用に及ぼす影響を調べることに興味を持っています。紅斑症は、糖尿病、鎌状赤血球貧血、サラセミアなどの多数の疾患に関連しています。
エリプト症を誘発するための再現性のプロトコルを持つことは、これらの分野の研究者が各分野に固有のさらなる科学的な質問を調査するのに役立ちます。
