높은 콜레스테롤은 심혈관 및 신경 퇴행성 질환의 주요 위험 요소입니다. 우리의 프로토콜은 콜레스테롤 혈증의 생리적 및 기계성 결과를 연구하기위한 귀중한 도구를 제공합니다. 이러한 절차는 기본 실험실 장비를 사용하여 수행 할 수 있으며 세포, 조직 및 제노푸스 난모세포에 적용됩니다.
콜레스테롤은 몸 전체에 세포 막의 주요 구성 요소. 이 기술은 어떤 세포 모형에 있는 콜레스테롤의 높은 수준의 충격을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 동맥을 해부하는 것이 가장 어려운 단계입니다.
조심스럽게 혈관 조직을 스트레칭하거나 손상시키지 않고 뇌에서 동맥을 제거하십시오. 지질은 매우 섬세하며, 그들과 함께 일하는 것은 과학보다 예술에 가중됩니다. 비디오 데모는 지질을 신중하게 처리하는 방법을 배우기 위한 가이드를 제공합니다.
콜레스테롤 포화 메틸 베타-사이클로덱스트린 용액을 준비하려면 먼저 064그램의 메틸 베타-사이클로덱스트린을 PBS 의 10 밀리리터에 추가하여 메틸 베타-사이클로덱스트린이 완전히 용해되도록 합니다. 다음으로, 플라스크에 0024 그램의 콜레스테롤 파우더를 넣고 주걱을 사용하여 가능한 한 많은 콜레스테롤 덩어리를 분해하여 용액을 적극적으로 저어줍니다. 거의 모든 콜레스테롤이 용해되었을 때, 파라핀 필름의 적어도 두 층플라스크를 밀봉.
그리고 하룻밤 사이에 섭씨 37도의 수탕에서 분당 약 30 진동으로 플라스크를 흔들어 주세요. 8 내지 16시간 후에, 22 마이크로미터 polyethersulfone 주사기 필터를 통해 혼합물을 동급 병으로 필터링하기 전에 실온에 용액을 식힙니다. 포유류 대뇌 동맥 농축을 위해, 250에서 300 그램 Sprague Dawley 쥐에서 얼음에 PBS의 비커로 뇌를 수확, 왁스 해부 그릇에 뇌를 전송하기 전에, 해부 현미경 아래, 조직을 침수하기에 충분한 PBS를 포함.
2~3개의 핀으로 뇌를 확보하여 혈관을 관통하지 않도록 하십시오. 그리고 날카로운 집게와 작은 수술 가위를 사용하여 뇌의 기지에서 윌리스의 원을 형성하는 대뇌 동맥과 가지를 부드럽게 해부합니다. 다음으로, PBS에서 1센티미터 길이의 동맥 세그먼트까지 간략하게 헹구고, 조직을 커버하기에 충분한 콜레스테롤 농축 용액에 헹구는 세그먼트를 배양합니다.
콜레스테롤 수치의 변화를 확인하려면 신선한 필리핀 분말 병을 사용하여 디메틸 설프리산화물의 염료의 밀리리터 스톡 용액당 10밀리그램을 준비하고, 콜레스테롤이 풍부한 조직을 신선한 PBS에서 35분간 세척하여 세척합니다. 마지막 세척 후, 실내 온도에서 10 분 동안 PBS에서 5 %트리톤에서 샘플을 투과화하기 전에, 빛으로부터 보호, 얼음에 4 %파라 포름 알데히드에 4 %의 para포름알데히드에 동맥 세그먼트를 수정합니다. 인큐베이션이 끝나면 셰이커에 PBS에서 35분 세척으로 티슈를 세척한 후 실온에서 1시간 동안 실온에서 1시간 동안 필리핀 염료 용액의 밀리리터 최종 농도당 25마이크로그램에 샘플을 추가합니다.
인큐베이션이 끝나면 동맥 조각을 세 번 씻고 증류수로 짧은 헹구는 것입니다. 마지막 세척 후, 실험실 조직을 사용하여 여분의 액체를 흡수하고 적절한 장착 매체를 사용하여 동맥을 슬라이드에 장착하십시오. 조심스럽게 커버 슬립으로 동맥을 덮고 조직의 롤링 또는 비틀림을 피하기 위해 주의를 기울이고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 24 시간 동안 슬라이드를 건조시키십시오.
마운팅 매체가 건조하면 뚜껑 슬립 엣지를 명확한 매니큐어로 밀봉하고 폴란드어가 10-15분 동안 건조할 수 있도록 합니다. 이어서, 340 내지 380 나노미터의 자궁내포를 가진 조직을 이미지화하고, 385 내지 470 나노미터의 방출을 한다. 인지질 기반 분산을 준비하려면 밀리리터 클로로폼 용해 지질 용액 당 10 밀리그램의 200 마이크로리터, L-알파-인파디에틸레타놀라민, 1-팔미토일-2-올레오일-글리페로-3-인포콜린, 콜레스테롤 을 12밀리리터 에 결합한다.
질소 스트림 아래 후드에서 클로로폼을 증발시키고, 완충된 150밀리머 칼륨과 10 밀리머 트리헤페스 용액의 800 마이크로리터에서 지질을 중단한다. 그런 다음 파라핀 필름으로 튜브를 밀봉하고, 유백색 혼합물이 형성될 때까지 80킬로헤르츠에서 튜브 내용을 10분 동안 부드럽게 초음파 처리합니다. 제노푸스 의 콜레스테롤 농축을 위해 날카로운 집게를 사용하여 여러 지역의 여성 제노푸스 라리비 개구리의 난소 낭을 방해하고 난소 덩어리를 콜라게나아제 밀리리터 당 5 밀리그램으로 보충한 칼슘 프리 ND96 5밀리리터가 있는 60mm 플레이트에 넣습니다.
실온에서 15분 동안 분당 60진동으로 궤도 셰이커에 티슈를 흔들어 주세요. 인큐베이션이 끝나면 넓은 팁이 있는 이송 파이펫을 사용하여 용액을 5~10회 파이펫하여 개별 난소동을 분리하고, 용액이 투명해질 때까지 신선한 칼슘 프리 ND96으로 다크 오사이클용액을 빠르게 헹구는다. 다음으로, 콜레스테롤 농축 인지질 기반 분산의 90 마이크로리터를 96웰 플레이트의 한 웰로 옮기고, 가능한 한 적은 배지로 최대 6개의 난초를 첨가한다.
96 웰 플레이트를 3차원 플랫폼 회전기위에 5~10분간 놓습니다. 그런 다음 ND96 한 방울을 우물에 추가하고 콜레스테롤 농축 난모세포를 즉각적인 분석을 위해 ND96을 포함하는 35mm 플레이트로 옮깁니다. 여기서, 이미지화된 대뇌 동맥 의 예평근육층은 콜레스테롤 농도가 증가함에 따라 조직 농축시 얻어진 필리핀 관련 형광의 농도 의존성 증가를 보여준다.
특히 메틸 베타-사이클로덱스트린 콜레스테롤 복합체로 치료한 후 3시간 후 콜레스테롤 수치가 농축 직후 의 수준에 비해 약 50% 감소했습니다. 1시간 의 배양 시간은 일반적으로 이 접근법 도중 콜레스테롤을 가진 조직 그리고 세포를 풍부하게 하기 위하여 이용되는 동안, 잠복의 5 분은 콜레스테롤 산화제 기지를 둔 생화학분석에 의해 결정된 대로 뇌동맥 콜레스테롤 콘텐츠에 있는 통계적으로 유의한 증가를 달성하기에 충분합니다. 콜레스테롤이 부족한 조절인 인지질 기반 분산으로 농축된 제노푸스 난모세포의 콜레스테롤 수치에서 유의한 변화가 관찰되지 는 않지만, 콜레스테롤을 포함하는 인지질 계 분산으로 5분 만에 콜레스테롤 수치가 크게 증가하고, 잠복시간이 60분으로 증가하면 이 수준으로 유지된다.
세포를 풍부하게 하기 위한 사이클로덱스트린 기반 접근법의 효과는 또한 해마의 CA1 영역에서 갓 분리된 뉴런에서 입증된다. 실제로, 메틸 베타-사이클로덱스트린에 있는 뉴런의 잠복은 60분 동안 콜레스테롤로 포화되어, 필리핀 관련 형광에 의해 평가된 바와 같이 콜레스테롤 수치가 2배 이상 증가합니다. 전반적으로, 이 절차에 대한 두 가지 가장 중요한 단계는 콜레스테롤 농축 혼합물을 준비하고 동맥 조직의 무결성을 보장하는 것입니다.
콜레스테롤 농축 에 이어, 하나는 콜레스테롤 혈 증에 의해 영향을 받는 단백질의 기능을 공부할 수 있습니다. 콜레스테롤을 가진 세포를 풍요롭게 하는 기능은 심근세포와 뉴런에 있는 높은 콜레스테롤 수치의 연구 결과 촉진했습니다. 난모 세포의 사용은 콜레스테롤이 이온 채널에 결합하는 방법을 조사 할 수 있었습니다.
실험실 코트와 장갑그녀는 항상이 프로토콜을 위해 착용할 수 있습니다. 클로로폼과 파라포름알데히드는 연기 후드 아래에 사용되어야 하며 유해 폐기물로 버려야 합니다.
