コレステロールの上昇は、心血管および神経変性疾患の主要な危険因子です。私たちのプロトコルは、高コレステロール血症の生理学的および機械学的な結果の両方を研究するための貴重なツールを提供します。これらの手順は、基本的なラボ機器を使用して実行することができ、細胞、組織、およびゼノプス卵母細胞に適用可能です。
コレステロールは、体全体の細胞膜の主要なコンポーネントです。.これらの技術は、任意の細胞型のコレステロールの上昇レベルの影響を研究するために利用することができます。動脈を解剖することは最も困難なステップです。
血管組織を伸ばしたり損傷したりすることなく、脳から動脈を慎重に取り除いてください。脂質は非常に繊細であり、それらを扱うことは科学よりも芸術です。ビデオデモンストレーションは、脂質を注意深く扱う方法を学ぶガイドを提供します。
コレステロール飽和メチル-β-シクロデキストリン溶液を調製するには、まず10ミリリットルのPBSに064グラムのメチル-β-シクロデキストリンを加え、攪拌バーで溶液をかき混ぜ、メチル-β-シクロデキストリンが完全に溶解することを確実にする。次に、フラスコに0024グラムのコレステロール粉末を加え、ヘラを使用してできるだけ多くのコレステロール塊を分解して溶液を激しく攪拌します。ほぼすべてのコレステロールが溶解したら、フラスコを少なくとも2層のパラフィンフィルムで密封する。
そして、一晩37度摂氏水浴で毎分約30振動でフラスコを振ります。8~16時間後、溶液を室温まで冷却し、22マイクロメートルのポリエーテルスルホンフィルターを通してクラスボトルに濾過します。哺乳類の大脳動脈濃縮のために、250〜300グラムのスプレイグ・ドーリーラットから氷上のPBSのビーカーに脳を収穫し、ワックス解剖ボウルに脳を移す前に、解剖顕微鏡の下で、組織を水没させるのに十分なPBSを含む。
2~3本のピンで脳を固定し、血管に浸透しないようにします。そして、鋭い鉗子と小さな外科用はさみを使用して、脳の基部にウィリスの円を形成する大脳動脈とその枝を穏やかに解剖します。次に、PBSで長い動脈セグメントを1センチメートルまで簡単にすすいでから、組織を覆うのに十分なコレステロール濃縮溶液でリンスされたセグメントをインキュベートする。
コレステロール値の変化を決定するには、新鮮なフィリパン粉末のボトルを使用して、ジメチルスルホキシドの染料の1ミリリットル当たり10ミリグラムのストック溶液を調製し、新鮮なPBSで3回の5分間の洗浄でコレステロール濃縮組織を洗浄します。最後の洗浄後、4%パラホルムアルデヒドで動脈セグメントを氷上で15分間固定し、光から保護し、PBSの5%トリトンでサンプルを室温で10分間透過させます。インキュベーションの終わりに、シェーカーでPBSで3回の5分間の洗浄で組織を洗浄し、サンプルを1ミリリットル当たり25マイクログラムのフィリピシン染料溶液に加える前に、室温で1時間、光から保護します。
インキュベーションの終わりに、示されているように動脈片を3回洗い、続いて蒸留水で短いすすいでください。最後の洗浄後、ラボ組織を使用して余分な液体を吸収し、適切な取り付け媒体を使用して動脈をスライドに取り付けます。慎重にカバースリップで動脈を覆い、組織の転がりやねじれを避けるように注意し、スライドを光から保護された室温で24時間乾燥させます。
取り付け媒体が乾燥したら、カバースリップエッジを透明なマニキュアで密封し、磨きを10〜15分間乾燥させます。次いで、340〜380ナノメートルの励起、および385〜470ナノメートルの放出で組織を画像化する。リン脂質ベースの分散液を調製するために、1ミリリットルクロロホルム溶解脂質溶液あたり10ミリグラムの200マイクロリットル、L-α-ホスファチジルエタノールアミン、1-パルミトイル-2-オレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、およびコレステロールを12ミリリットルガラスチューブに組み合わせます。
窒素の流れの下でフード内のクロロホルムを蒸発させ、脂質を800マイクロリットルの緩衝された塩化150ミリモルカリウムおよび10ミリモルトリスHEPES溶液で懸濁させる。その後、パラフィンフィルムでチューブを密封し、乳白色の混合物が形成されるまで、80キロヘルツでチューブの内容物を10分間穏やかに超音波処理します。ゼノプス卵母細胞のコレステロール濃縮のために、鋭い鉗子を使用して複数の領域の女性ゼノプス・ラエビスカエルから卵巣嚢を破壊し、卵巣塊を60ミリプレートに入れ、5ミリリットルのカルシウムフリーND96を60ミリプレートに入れ、1ミリリットルのコラゲラーゼ1ミリグラムを補う。
室温で15分間毎分60回振動して軌道シェーカーの組織を振ります。インキュベーションの最後に、広い先端を持つ移管ピペットを使用して、卵母細胞含有溶液を5〜10回精力的にピペットして個々の卵母細胞を分離し、溶液が透明になるまで新鮮なカルシウムフリーND96で暗い卵母細胞溶液を素早くすすぐ。次に、90マイクロリットルのコレステロールを濃縮したリン脂質ベースの分散液を96ウェルプレートの1ウェルに移し、できるだけ少ない媒体で6個までの卵母細胞をウェルに加える。
96ウェルプレートを3次元プラットフォーム回転器に5~10分間置きます。その後、ウェルにND96の滴を加え、コレステロール濃縮卵母細胞をND96を含む35ミリメートルプレートに移して即時分析します。ここで、画像化された大脳動脈平滑筋層の一例は、コレステロールの濃度の増加に伴う組織濃縮時に得られるフィリミン関連蛍光の濃度依存性の増加を示す。
特にメチル-β-シクロデキストリンコレステロール複合体による治療後3時間は、コレステロール値が濃縮直後のレベルと比較して約50%減少した。このアプローチの間に1時間のインキュベーション時間がコレステロールを持つ組織および細胞を豊かにするために一般的に使用されるが、インキュベーションの5分は通常、コレステロールオキシダーゼベースの生化学的アッセイによって決定される脳動脈コレステロール含有量の統計的に有意な増加を達成するのに十分である。コレステロールを欠いたコントロールリン脂質ベースの分散液を有するゼノプス卵母細胞のコレステロール値には有意な変化は認められないが、コレステロール値はコレステロールを含むリン脂質ベースの分散液で5分しか処理を行った後に有意に増加し、インキュベーション時間が60分に増加するとこのレベルにとどまる。
細胞を濃縮するためのシクロデキストリンベースのアプローチの有効性は、海馬のCA1領域から新たに単離されたニューロンにおいても実証されている。実際、メチル-β-シクロデキストリン中のニューロンのインキュベーションは、60分間コレステロールで飽和し、フィリピシン関連蛍光によって評価されるようにコレステロール値の2倍以上の増加をもたらす。全体的に、これらの手順のための2つの最も重要なステップは、コレステロール濃縮混合物を調製し、動脈組織の完全性を確保することである。
コレステロールの濃縮に続いて、高コレステロール血症の影響を受けるタンパク質の機能を研究することができます。コレステロールを持つ細胞を豊かにする能力は、心筋細胞およびニューロンにおけるコレステロール値の上昇の研究を促進した。卵母細胞の使用は、コレステロールがイオンチャネルにどのように結合するかを調査することができました。
彼女はいつもこのプロトコルのために着用されるラボコートと手袋。クロロホルムとパラホルムアルデヒドは、ヒュームフードの下で使用し、有害廃棄物として廃棄する必要があります。
