Yüksek kolesterol kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalık için önemli bir risk faktörüdür. Protokollerimiz hiperkolesteroleminin hem fizyolojik hem de mekanik sonuçlarını incelemek için değerli araçlar sağlamaktadır. Bu işlemler temel laboratuvar ekipmanları kullanılarak gerçekleştirilebilir ve hücreler, dokular ve Ksenopus oositleri için geçerlidir.
Kolesterol vücutta hücresel membranların önemli bir bileşenidir. Bu teknikler herhangi bir hücre tipinde kolesterol yüksek düzeyde etkisini incelemek için kullanılabilir. Arterlerin kesilmesi en zor adımdır.
Dikkatle beyinden arter kaldırmak, germe veya vasküler doku zarar vermeden. Lipidler çok hassastır ve onlarla çalışmak bir bilimden çok bir sanattır. Video gösteri dikkatle lipidler işlemek için nasıl öğrenmek için bir rehber sağlar.
Kolesterol doymuş metil-beta-siklodekstrin çözeltisi hazırlamak için, ilk pbs 10 mililitre metil-beta-siklodekstrin 064 gram ekleyin, bir karıştırma çubuğu ile çözelti karıştırma, metil-beta-siklodekstrin tam olarak çözülür sağlamak için. Sonra, şişeye kolesterol tozu 0024 gram ekleyin ve mümkün olduğunca çok sayıda kolesterol parçaları kırmak için bir spatula kullanarak, şiddetle çözüm karıştırın. Neredeyse tüm kolesterol çözülmüş olduğunda, parafin film en az iki kat ile şişe mühür.
Ve bir gecede 37 derece santigrat derece su banyosunda dakikada yaklaşık 30 salınımlarda şişeyi sallayın. Sekiz ila 16 saat sonra, karışımı 22 mikrometrelik polyethersulfone şırınga filtresinden sınıf bir şişeye filtrelemeden önce çözeltiyi oda sıcaklığına kadar soğutun. Memeli serebral arter zenginleştirme için, 250 ila 300 gram Sprague Dawley sıçan buz üzerinde PBS bir beher içine beyin hasat, bir mumlu diseksiyon kase içine beyin aktarmadan önce, bir diseksiyon mikroskop altında, doku batırmak için yeterli PBS içeren.
Beyni 2-3 iğneyle sabitle, kan damarlarına girmemelerini sağla. Ve keskin forsepsler ve küçük cerrahi makas kullanarak beyin arterlerini ve beynin tabanında Kisis Çemberi'ni oluşturan dallarını nazikçe inceleyin. Daha sonra, kısaca PBS bir santimetre uzunluğunda arter segmentleri kadar durulayın, dokuları kapsayacak kadar kolesterol zenginleştirici çözüm durulanmış segmentleri kuluçkadan önce.
Kolesterol düzeyinde herhangi bir değişiklik belirlemek için, dimetil sülfoksit boya mililitre stok çözeltisi başına 10 miligram hazırlamak için filipin tozu taze bir şişe kullanın ve taze PBS üç beş dakikalık yıkar ile kolesterol zenginleştirilmiş dokuları yıkayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika pbs% 5 Triton örnekleri permeabilizing önce, ışıktan korunan buz üzerinde 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit arter segmentleri düzeltmek. Kuluçka sonunda, bir shaker üzerinde PBS üç beş dakikalık yıkar ile dokuları yıkayın, filipin boya çözeltisi mililitre son konsantrasyonu başına 25 mikrogram örnekleri eklemeden önce, oda sıcaklığında bir saat boyunca, ışıktan korunan.
Kuluçka sonunda, arter parçalarını gösterildiği gibi üç kez yıkayın, ardından damıtılmış suyla kısa bir durulama. Son yıkamadan sonra, herhangi bir aşırı sıvı emmek için bir laboratuvar dokusu kullanın, ve uygun bir montaj ortamı kullanarak bir slayt üzerine arterler monte. Dikkatle bir kapak kayma ile arterler kapağı, yuvarlanma veya doku büküm önlemek için özen, ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca slayt kuru izin, ışıktan korunarak.
Montaj ortamı kuruduğunda, kapak kapak kenarlarını açık ojeile kapatın ve cilanın 10 ila 15 dakika kurumasını bekleyin. Daha sonra, 340-380 nanometre bir uyarma ve 385-470 nanometre bir emisyon ile doku görüntü. Fosfolipid bazlı dağılım hazırlamak için, mililitre kloroform çözünmüş lipid çözeltisi başına 10 miligram 200 mikrolitre birleştirmek lipid çözeltisi, L-alfa-fosfatidiletanolamine, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin, ve kolesterol 12 mililitre cam tüp.
Bir azot akışı altında kaputtaki kloroformu buharlaştırın, 800 mikrolitre lik havalenyağan 150 milimolar potasyum klorür ve 10 milimolar Tris HEPES çözeltisi lipidleri askıya alın. Sonra parafin film ile tüp mühür ve yavaşça bir sütlü karışım oluşana kadar, 10 dakika boyunca 80 kilohertz tüp içeriğini sonicate. Xenopus oositlerin kolesterol zenginleştirme için, birden fazla bölgede bir kadın Xenopus laevis kurbağa yumurtalık kese bozmak için keskin forseps kullanın, ve kalsiyum içermeyen ND96 beş mililitre ile 60 milimetrelik bir plaka içine yumurtalık parçaları yerleştirin kollajenazın mililitre başına 5 miligram ile takviye.
Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dakikada 60 salınımda bir orbital shaker üzerinde doku sallayın. Kuluçka sonunda, tek tek yumurtaları izole etmek için çözelti içeren yumurtayı beş ila 10 kez güçlü bir şekilde pipetlemek için geniş uçlu bir transfer pipetkullanın ve çözelti şeffaf hale gelene kadar koyu yumurta çözeltisini taze kalsiyumsuz ND96 ile hızlı bir şekilde durulayın. Sonra, kolesterol zenginleştirilmiş fosfolipid bazlı dağılım 90 mikrolitre bir kuyu içine 96 iyi plaka, ve mümkün olduğunca az orta ile de altı oosit ekleyin.
5 ila 10 dakika için üç boyutlu bir platform rotator üzerine 96 iyi plaka yerleştirin. Sonra kuyuya ND96 bir damla ekleyin ve kolesterol zenginleştirilmiş yumurta transferi 35 milimetrelik plaka nd96 içeren onların hemen analiz için. Burada, bir görüntülenmiş serebral arter düz kas tabakası bir örnek kolesterol artan konsantrasyonları ile doku zenginleştirme üzerine elde filipin ilişkili floresan konsantrasyonbağımlı artış göstermektedir.
Özellikle metil-beta-siklodekstrin kolesterol kompleksi ile tedaviden üç saat sonra kolesterol düzeyleri zenginleştirme hemen sonra kendi seviyesine göre yaklaşık% 50 oranında azalmıştır. Bir saat kuluçka süresi yaygın olarak bu yaklaşım sırasında kolesterol ile doku ve hücreleri zenginleştirmek için kullanılırken, kuluçka beş dakika genellikle kolesterol oksidaz bazlı biyokimyasal dosay tarafından belirlenen serebral arteriyel kolesterol içeriğinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış elde etmek için yeterlidir. Kolesteroleksikliği olan kontrol fosfolipid bazlı dağılımlarla zenginleştirilmiş Xenopus oositlerinde kolesterol düzeylerinde önemli bir değişiklik gözlenmezken, kolesterolü de içeren fosfolipid bazlı dağılımlarla tedavinin sadece beş dakika sonra kolesterol düzeyleri önemli ölçüde artar ve kuluçka süresi 60 dakikaya çıkarıldığında bu seviyede kalır.
Hücreleri zenginleştirmek için siklodekstrin bazlı yaklaşımın etkinliği de hipokampus CA1 bölgesinden yeni izole nöronlarda gösterilmiştir. Nitekim, metil-beta-siklodekstrin nöronların kuluçka 60 dakika kolesterol ile doymuş kolesterol düzeylerinde iki kat üzerinde bir artış ile sonuçlanır, filipin ilişkili floresan tarafından değerlendirildiği gibi. Genel olarak, bu işlemler için en önemli iki adım kolesterol zenginleştirme karışımı hazırlanması ve arteriyel doku bütünlüğünü sağlamak.
Kolesterol zenginleştirme sonrasında, bir hiperkolesterolemi etkilenen proteinlerin işlevini inceleyebilirsiniz. Kolesterol ile hücreleri zenginleştirmek için yeteneği kardiyomiyositler ve nöronlarda yüksek kolesterol düzeylerinin çalışmasını kolaylaştırdı. Yumurtaların kullanımı, kolesterolün iyon kanallarına nasıl bağdaştırdığını araştırmamıza olanak sağladı.
Bir laboratuvar önlüğü ve eldivenler bu protokol için her zaman giyilir. Kloroform ve paraformaldehit bir duman başlığı altında kullanılmalı ve tehlikeli atık olarak atılmalıdır.
