ヒトの生物学と低分子化合物の神経毒性評価に非常に関連する神経突起伸長アッセイを記述する提示されたプロトコル。ヒト初代ヒト細胞モデルとしてのヒト神経前駆細胞の翻訳ポテンシャルと生理学的関連性が高く、神経突起性創薬スクリーニングおよび神経毒性評価において大きな利点を提供する。提示されたプロトコルを利用して、ヒト誘導多能性幹細胞およびヒト胚性幹細胞由来ニューロンは、神経突起増殖アッセイおよび神経毒性評価のための代替細胞源として使用することもできる。
浮動神経球でメディアを収集し、50ミリリットルの円錐管に移すことから始めます。3分間300〜400回gでチューブを遠心分離する。その後、慎重に上清を吸引します。
解凍した細胞解離試薬の500マイクロリットルで球を再懸濁させる。球体を摂氏37度で5~15分間インキュベートします。その後、5〜10ミリリットルの事前温めた培養培地を加え、チューブを300〜400倍gで5分間遠心分離し、神経球を沈殿させます。
上清を吸引し、神経圏が単一の細胞懸濁液を形成するまで、1000マイクロリットルピペットで上下にピペット化する2ミリリットルの文化メディアを加える。細胞を数えた後、10ミリリットルの培養培地中のT25フラスコに200万~300万個の細胞を加える。3 日ごとに半分の培養メディアを交換します。
市販の凍結保存培地を使用して細胞を凍結する。神経球を50ミリリットルのチューブに移し、球体を底に落ち着かせる。200または1000マイクロリットルピペットチップを使用して、大きな神経球を新しい50ミリリットルチューブに移してから通過します。
残りの神経球を300〜400回gで3分間遠心し、上清を慎重に除去する。1ミリリットルの凍結保存試薬で最大1000個の球体を再懸濁し、凍結管に移します。チューブをマイナス80度で一晩保管し、液体窒素に移動して長期保存します。
神経細胞の伸びを測定するには、フィジーで画像を開き、分析、ツール、ROIマネージャーを選択します。ツールバーの「ストレート」の5番目のアイコンを右クリックし、フリーハンドラインに切り替えます。必要に応じて、同じアイコンをダブルクリックして、線幅を 10 に変更します。
その後、細胞本体の近くで始まり、先端まで延びる最も長い神経突起を追跡します。コントロールと T を押してから F キーを押して測定を ROI マネージャに追加し、測定したニューロンをハイライトします。ROI 内のすべての数値を選択します。
[計測]をクリックし、測定値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。ラベル付けされた細胞の蛍光強度を測定するには、ツールバーのフリーハンド選択の4番目のアイコンをクリックし、セルの形状を描画します。[分析]をクリックし、[測定を設定]をクリックします。
次に、[面積]、[平均グレー値]、[最小最大グレー値]、[統合密度] が選択されていることを確認します。[分析と測定] をクリックします。セルの横にある領域を背景として選択します。
次に、[分析と測定] をクリックします。すべてのメジャー データを選択してコピーし、スプレッドシートに貼り付けます。プレートをコーティングするには、384ウェルプレートの各ウェルに30マイクロリットルのポリL-リジンを加え、室温で1時間インキュベートします。
PBSで2回洗い、約30分間乾燥させます。各井戸に30マイクロリットルのラミニンを加え、2時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。PBSでのスメを繰り返し、細胞のめっきを行います。
384ウェルプレートの各ウェルに25マイクロリットルの分化培地に20,000個の単細胞神経球を加え、5日間摂氏37度でプレートをインキュベートします。高精密ピペット技術は、単一細胞に分離された神経球の正確な数をめっきするために必要とされます。したがって、より再現性のある結果を得るために、メッキ前に神経球をニューロンに分化することが推奨される。
インキュベーション後、所望の濃度の6倍の各ウェルに5マイクロリットルの試験化合物を加える。さらに24時間培養します。細胞生存率エッセイを実行するには、各ウェルに30マイクロリットルの発光試薬を加えます。
そして、2分間シェーカーの上にプレートを残します。プレートを300〜400回gで30秒間遠心し、室温で10分間インキュベートし、光から保護します。インキュベーション後、マイクロプレートリーダー上の発光を測定します。
ヒト神経前駆細胞由来ニューロンを用いて、低分子化合物の神経突起の拡張とその後の神経原性能力に対する低分子エピジェニック化合物としてのHDAC阻害剤の効果を調べた。HDAC阻害剤の神経毒性はまた、384ウェルプレートで神経前駆細胞を分化した後に評価され、より多くの化合物に対するプロトコルをスケーリングする可能性を示した。別の研究では、エピジェネティック修飾化合物でニューロンを治療した後、ヒストンH4リシン5アセチル化の豊富さをヒストンマーカーとして定量するために、神経細胞蛍光強度の測定が用いられた。
さらに、このプロトコルは、シナプス前タンパク質、シナプトフィシンを可視化し、低分子化合物のシナプト原性効果をチェックするために使用されています。提示された方法を用いて、ニューライト数、強度、長さ、および幅、シナプス前およびシナプス後タンパク質修飾を含むシナプス特性を確実に測定することができた。
