Представленный протокол, описывающий анализ neurite outgrowth, который имеет большое значение для биологии человека и оценки нейротоксичности небольших молекул соединений. Высокий трансляционный потенциал и физиологическая значимость клеток-предшественников человека как основной модели клеток человека дают значительное преимущество в скрининге на открытие лекарственных препаратов, связанном с нейритом, и оценке нейротоксичности. Используя представленный протокол, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки и нейроны, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, также могут быть использованы в качестве альтернативных источников клеток для анализа нараста neurite и оценки нейротоксичности.
Начните с сбора средств массовой информации с плавающей нейросферы и передачи его в 50 миллилитров конической трубки. Центрифуга трубки на 300 до 400 раз г в течение трех минут. Затем осторожно аспирировать супернатант.
и повторное приостановление сфер в 500 микролитров размораживания реагентов диссоциации клеток. Инкубировать сферы при 37 градусах по Цельсию в течение пяти-пяти минут. Затем добавьте от 5 до 10 миллилитров предварительно разогретых культурных средств массовой информации и центрифуг трубки при 300-400 раз г в течение пяти минут, чтобы отогреть нейросферы.
Аспирировать супернатант и добавить два миллилитров культурных средств массовой информации трубы вверх и вниз с 1000 микролитров пипетки, пока нейросферы образуют одну подвеску клетки. После подсчета ячеек добавьте от двух до 3 миллионов ячеек в колбу T25 в 10 миллилитров культурных медиа. Заменить половину культуры средств массовой информации каждые три дня.
Используйте коммерчески доступные криоконсервации среды заморозить клетки. Перенесите нейросферы в 50 миллилитровую трубку и позвольте сферам осесть внизу. Используйте наконечник пипетки 200 или 1000 микролитров для переноса больших нейросфер в новую 50-миллилитровую трубку перед передачей.
Центрифуга оставшихся нейросфер при 300-400 раз г в течение трех минут и тщательно удалить супернатант. Посовещение до тысячи сфер в один миллилитр криоконсервации реагента и передать его в крио трубки. Храните трубку на ночь при температуре минус 80 градусов по Цельсию, а затем перемести ее в жидкий азот для длительного хранения.
Для измерения прорастание нейронов откройте изображение на Фиджи и выберите менеджер по анализу, инструментам и рентабельности инвестиций. Нажмите правой кнопкой мыши на пятый значок в баре инструментов Straight и переключитесь на Freehand Line. Дополнительно дважды нажмите на один и тот же значок, чтобы изменить ширину линии до 10.
Затем проследите самый длинный нейрит, начинающийся вблизи тела клетки и простирающийся до кончика. Управление прессой и T затем F, чтобы добавить измерения roi Manager и выделить измеренный нейрон. Выберите все номера в рентабельности инвестиций.
Нажмите на меру, затем скопировать и вставить измерения в электронную таблицу. Чтобы измерить интенсивность флуоресценции помеченных ячеек, нажмите на четвертый значок в панели инструментов Freehand Selections и нарисуйте форму клетки. Нажмите Анализ и Установите измерения.
Затем убедитесь, что область, среднее серое значение, Мин макс серое значение и интегрированная плотность выбраны. Нажмите Анализ и измерения. Выберите область рядом с ячейкой в качестве фона.
А затем нажмите проанализировать и измерить. Выберите все данные измерения и скопировать, вставьте их в электронную таблицу. Чтобы покрыть пластину добавить 30 микролитров поли-L-лизина в каждый колодец 384-хорошо пластины и инкубировать пластины при комнатной температуре в течение одного часа.
Вымойте его дважды с PBS и дайте ему высохнуть в течение примерно 30 минут. Добавьте 30 микролитров ламинина к каждому колодец, затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. Повторите моет с PBS и приступить к покрытие клеток.
Добавьте 20 000 одноклеточных нейросфер в 25 микролитров средств дифференциации к каждой пластине из 384-хорошо и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение пяти дней. Высокоточная точность пипетки навыки необходимы для покрытия точное количество нейросфер, которые все разделены на одиночные клетки. Таким образом, дифференциация нейросфер в нейроны до покрытия рекомендуется для достижения более воспроизводимых результатов.
После инкубации добавьте пять микролитров испытательного соединения к каждой хорошо в шесть раз желаемой концентрации. И инкубировать клетки еще 24 часа. Для выполнения эссе жизнеспособности клеток добавьте 30 микролитров люминесцентного реагента к каждому хорошо.
И оставьте тарелку на шейкере на две минуты. Центрифуга пластины при температуре от 300 до 400 раз г в течение 30 секунд, затем инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 10 минут, защищая его от света. После инкубации измерьте люминесценцию на считыватель микроплюсов.
Нейроны, полученные клетками-предшественниками человека, использовались для изучения влияния ингибиторов HDAC как небольших молекул эпигенных соединений для расширения невритов и последующей нейрогенной способности небольших молекулярных соединений. Нейротоксичность ингибиторов HDAC была также оценена после дифференциации нейронных клеток-предшественников в 384-хорошо пластин, показывая потенциал для масштабирования протокола для большего числа соединений. В другом исследовании, измерение интенсивности флуоресценции нейрональных клеток было использовано для количественной оценки изобилия гистона H4 лизина пять ацетилляции в качестве маркера гистона после лечения нейронов с эпигенетическими соединениями модификатора.
Кроме того, этот протокол был использован для визуализации досинаптического белка, синаптофизин, чтобы проверить на возможные синаптогенные эффекты небольших соединений молекул. Используя представленный метод, можно было бы надежно измерить число невритов, интенсивность, длину и ширину, а также синаптические характеристики, включая пред- и пост-синаптические модификации белка.
