El protocolo presentado que describe el ensayo de crecimiento de neurita que es muy relevante para la evaluación de la biología humana y la neurotoxicidad de un compuesto de molécula pequeña. El alto potencial traslacional y la relevancia fisiológica de las células progenitoras neuronales humanas como el modelo de células humanas primarias ofrecen una ventaja considerable en el cribado de fármacos relacionados con el crecimiento de neuritas y la evaluación de la neurotoxicidad. Utilizando el protocolo presentado, las células madre pluripotentes inducidas por humanos y las neuronas derivadas de células madre embrionarias humanas también se pueden utilizar en cuanto a fuentes celulares alternativas para el ensayo de crecimiento de neurito y la evaluación de la neurotoxicidad.
Comience por recolectar los medios con neuroesferas flotantes y transferirlos a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el tubo a 300 a 400 veces g durante tres minutos. Entonces aspira cuidadosamente el sobrenadante.
y resuspender las esferas en 500 microlitros de reactivo de disociación celular descongelada. Incubar las esferas a 37 grados centígrados durante cinco a 15 minutos. Luego agregue de cinco a 10 mililitros de medios de cultivo precalentó y centrifugar el tubo a 300 a 400 veces g durante cinco minutos para sedimentar las neuroesferas.
Aspirar el sobrenadante y añadir dos mililitros de medios culturales pipeteando arriba y abajo con una pipeta de 1000 microlitros hasta que las neuroesferas formen una suspensión de una sola célula. Después de contar las células, agregue de dos a 3 millones de células a un matraz T25 en 10 mililitros de medios de cultivo. Reemplace la mitad de los medios de cultivo cada tres días.
Utilice un medio de criopreservación disponible comercialmente para congelar las células. Transfiera las neuroesferas a un tubo de 50 mililitros y permita que las esferas se asienten en la parte inferior. Utilice una punta de pipeta de 200 o 1000 microlitros para transferir las grandes neuroesferas a un nuevo tubo de 50 mililitros antes de pasar.
Centrifugar las neuroesferas restantes a 300 a 400 g durante tres minutos y retire cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender hasta mil esferas en un mililitro de reactivo de criopreservación y transferirlo a un tubo crio. Almacene el tubo durante la noche a menos 80 grados centígrados, luego muévalo a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
Para medir el crecimiento neuronal, abra la imagen en Fiji y seleccione Analizar, Herramientas y Administrador de ROI. Haga clic con el botón derecho en el quinto icono de la barra de herramientas Recto y cambie a Línea a mano alzada. Si lo desea, haga doble clic en el mismo icono para cambiar el ancho de línea a 10.
Luego traza la neurita más larga comenzando cerca del cuerpo celular y extendiéndose hasta la punta. Presione Control y T y luego F para agregar la medición al Administrador de ROI y resalte la neurona medida. Seleccione todos los números en el ROI.
Haga clic en Medir y, a continuación, copie y pegue las medidas en una hoja de cálculo. Para medir la intensidad de fluorescencia de las celdas etiquetadas, haga clic en el cuarto icono de la barra de herramientas Selecciones a mano alzada y dibuje la forma de la celda. Haga clic en Analizar y establecer medidas.
A continuación, asegúrese de que se seleccionan Area, Mean gray value, Min max grey value y Integrated density. Haga clic en Analizar y medir. Seleccione la región junto a la celda como fondo.
Y luego haz clic en analizar y medir. Seleccione todos los datos de medida y cópielos, péguelos en una hoja de cálculo. Para recubrir la placa añadir 30 microlitros de poli-L-lisina en cada pocópido de una placa de 384 pocillos e incubar la placa a temperatura ambiente durante una hora.
Lávelo dos veces con PBS y déjelo secar durante aproximadamente 30 minutos. Añadir 30 microlitros de laminina a cada pozo, luego incubar la placa a 37 grados Celsius durante dos horas. Repita los lavados con PBS y proceda con el revestimiento de las células.
Añadir 20.000 neuroesferas de una sola célula en 25 microlitros de medios de diferenciación a cada pozo de la placa de 384 pozos e incubar la placa a 37 grados Centígrados durante cinco días. Se requieren habilidades de pipeteo de alta precisión para encotar el número exacto de neuroesferas que está segregada en células individuales. Por lo tanto, se recomienda diferenciar las neuroesferas en las neuronas antes de encogerse para lograr resultados más reproducibles.
Después de la incubación, añadir cinco microlitros de compuesto de prueba a cada pozo a seis veces la concentración deseada. Y incubar las células durante otras 24 horas. Para realizar el ensayo de viabilidad celular, añada 30 microlitros de reactivo luminiscente a cada pozo.
Y deja el plato en una coctelera durante dos minutos. Centrifugar la placa a 300 a 400 veces g durante 30 segundos, luego incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos, protegiéndola de la luz. Después de la incubación, mida la luminiscencia en un lector de microplacas.
Las neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas se utilizaron para examinar el efecto de los inhibidores de HDAC como compuestos epigénicos de molécula pequeña para la extensión de neuritas y la capacidad neurogénica posterior de compuestos de moléculas pequeñas. La neurotoxicidad de los inhibidores de la HDAC también se evaluó después de diferenciar las células progenitoras neuronales en placas de 384 pozos, mostrando el potencial de escalar el protocolo para un mayor número de compuestos. En un estudio diferente, la medición de la intensidad de fluorescencia de la célula neuronal se utilizó para cuantificar la abundancia de histona H4 lisina cinco acetilación como un marcador de histona después de tratar las neuronas con compuestos modificadores epigenéticos.
Además, este protocolo se ha utilizado para visualizar una proteína presináptica, sinaptofisina, para comprobar posibles efectos sinaptogénicos de compuestos de moléculas pequeñas. Utilizando el método presentado, el número, la intensidad, la longitud y la anchura de las neuritas, junto con las características sinápticas, incluidas las modificaciones previas y postsópticas de proteínas, podrían medirse de forma fiable.
