İnsan biyolojisi ve küçük molekül bileşiklerinin nörotoksisite değerlendirmesi ile son derece alakalı olan neurite outgrowth testini açıklayan sunulan protokol. Birincil insan hücre modeli olarak insan nöral progenitor hücrelerinin yüksek çeviri potansiyeli ve fizyolojik önemi, neurite büyümeile ilişkili ilaç keşif taraması ve nörotoksisite değerlendirmesinde önemli bir avantaj sağlamaktadır. Sunulan protokolden yararlanarak, insan kaynaklı pluripotent kök hücre ve insan embriyonik kök hücre kaynaklı nöronlar da nötrit outgrowth test ve nörotoksisite değerlendirmesi için alternatif hücre kaynakları olarak kullanılabilir.
Yüzen nörosferler ile medya toplama ve 50 mililitrekonik tüp aktararak başlayın. Tüpü 300-400 kez g olarak üç dakika santrifüj edin. Sonra dikkatle supernatant aspire.
ve çözülmüş hücre bölünmesi reaktifinin 500 mikrolitresindeki küreleri yeniden askıya alın. Küreleri 37 derecede 5-15 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra önceden ısıtılmış kültür medya beş ila 10 mililitre ekleyin ve nörosferler tortu için beş dakika için 300 ila 400 kez g tüp santrifüj.
Supernatant aspirate ve nörosferler tek bir hücre süspansiyon oluşturana kadar 1000 mikrolitre pipet ile yukarı ve aşağı boru lama kültürel medya iki mililitre ekleyin. Hücreleri sayarak, kültür medya 10 mililitre bir T25 şişesine iki ila 3 milyon hücre ekleyin. Her üç günde bir kültür medyasının yarısını değiştirin.
Hücreleri dondurmak için ticari olarak kullanılabilen kriyopreservation ortamını kullanın. Nörosferleri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kürelerin dibe yerleşmesini bekleyin. Büyük nörosferleri passetmeden önce yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarmak için 200 veya 1000 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.
Kalan nörosferleri 300 ila 400 kez g'de üç dakika santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Bir mililitre kriyatisi reaktifinde bin küreye kadar yeniden askıya alın ve kriyo tüpüne aktarın. Tüpü bir gecede eksi 80 derecede saklayın, sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojene taşıyın.
Nöronal büyümeyi ölçmek için Fiji'deki görüntüyü açın ve Analyze, Tools ve ROI Manager'ı seçin. Düz araç çubuğundaki beşinci simgeye sağ tıklayın ve Freehand Line'a geçin. İsteğe bağlı olarak, satır genişliğini 10'a değiştirmek için aynı simgeye çift tıklayın.
Sonra hücre gövdesi yakınında başlayan ve ucuna uzanan en uzun neurite iz. Ölçümyatını Yatırım Getirisi Yöneticisi'ne eklemek ve ölçülen nöronu vurgulamak için Kontrol ve T tuşuna basın. YG'deki tüm sayıları seçin.
Ölçü'ye tıklayın, ardından ölçümleri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın. Etiketli hücrelerin floresan yoğunluğunu ölçmek için Freehand Seçimleri araç çubuğundaki dördüncü simgeyi tıklatın ve hücrenin şeklini çizin. Ölçümleri Analiz et ve Ayarla'yı tıklatın.
Daha sonra Alan, Ortalama gri değeri, Min max gri değeri ve Tümleşik yoğunluğu seçildiğinden emin olun. Analiz et ve ölç'e tıklayın. Arka plan olarak hücrenin yanındaki bölgeyi seçin.
Ve sonra analiz ve ölçmek tıklatın. Tüm ölçüm verilerini seçin ve kopyalayın, elektronik tabloya yapıştırın. Plakayı kaplamak için 384 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 30 mikrolitre poli-L-lizin ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.
PBS ile iki kez yıkayın ve yaklaşık 30 dakika kurulayın. Her kuyuya 30 mikrolitre laminine ekleyin, sonra tabağı 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. PBS ile yıkıntıları tekrarlayın ve hücreleri kaplamaya devam edin.
384 kuyulu plakanın her kuyusuna 25 mikrolitre farklılaşma ortamına 20,000 tek hücreli nörosfer ekleyin ve plakayı 5 gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Yüksek hassasiyetli pipetleme becerileri, tek bir hücreye ayrılmış olan nörosferlerin tam sayısını kaplamak için gereklidir. Bu nedenle, kaplama önce nöronlar içine nörosferler ayırt daha tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tavsiye edilir.
Kuluçkadan sonra, her kuyuya istenilen konsantrasyonun altı katı kadar beş mikrolitre test bileşiği ekleyin. Ve hücreleri 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Hücre canlılığı kompozisyon gerçekleştirmek için, her kuyuya 30 mikrolitre parlak reaktif ekleyin.
Ve tabağı iki dakika çalkalayın. Plakayı 30 saniye boyunca 300 ila 400 kez g olarak santrifüj edin, ardından oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın ve ışıktan koruyun. Kuluçkadan sonra, bir mikroplaka okuyucu üzerinde parlaklık ölçün.
İnsan nöral progenitor hücre kaynaklı nöronlar nöritlerin uzantısı ve küçük molekül bileşiklerinin sonraki nörojenik yeteneği için küçük molekül epijenik bileşikler olarak HDAC inhibitörlerinin etkisini incelemek için kullanılmıştır. HDAC inhibitörlerinin nörotoksisitesi de 384-iyi plakalar nöral progenitor hücreleri ayırt sonra değerlendirildi, bileşiklerin daha yüksek sayıda için protokolü ölçeklendirme potansiyelini gösteren. Farklı bir çalışmada, nöronların epigenetik modifiye bileşikleri ile tedavi edilmesinden sonra histon H4 lizin beş asetilasyonun bolluğunu histon belirteç olarak ölçmek için nöronal hücre floresan yoğunluğuölçümü kullanılmıştır.
Ayrıca, bu protokol bir pre-sinaptik protein görselleştirmek için kullanılmıştır, sinaptofirin, küçük molekül bileşiklerinin olası sinaptojenik etkileri kontrol etmek için. Sunulan yöntem kullanılarak, nöritsayısı, yoğunluk, uzunluk ve genişlik, sinaptik özellikleri ile birlikte, pre ve post-sinaptik protein modifikasyonları da dahil olmak üzere güvenilir bir şekilde ölçülebilir.
