הפרוטוקול המוצג המתאר נויריט נויריט הערכה כי הוא רלוונטי מאוד ביולוגיה אנושית הערכת neurotoxicity של תרכובות מולקולה קטנה. פוטנציאל תרגום גבוה רלוונטיות פיזיולוגית של תאים מולדים עצביים אנושיים כמו מודל התא האנושי העיקרי מציעים יתרון ניכר בהקרנת גילוי סמים הקשורים neurite outgrowth והערכה neurotoxicity. ניצול הפרוטוקול המוצג, תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם ותאי עצב אנושיים שמקורם בתאי גזע עובריים יכולים לשמש גם למקורות תאים חלופיים עבור בדיקה של נויריט והערכת נוירוטוקסיות.
התחל על ידי איסוף התקשורת עם נוירוספרות צפות והעברתו לצינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 300 עד 400 פעמים g במשך שלוש דקות. ואז בזהירות שאף את העל-טבעי.
ולחדש את הספירות ב-500 מיקרוליטרים של ניתוב תאים מפופשר. דגירה הכדורים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד 15 דקות. לאחר מכן להוסיף חמישה עד 10 מיליליטר של תקשורת תרבות מחוממת מראש צנטריפוגה הצינור ב 300 עד 400 פעמים g במשך חמש דקות כדי לגרד את הנוירוספרות.
שאפו את העל-טבעי והוסיפו שני מיליליטר של מדיה תרבותית עם פיפט של 1000 מיקרוליטר עד שהנוירוספרות יוצרות השעיה של תא אחד. לאחר ספירת התאים, להוסיף שניים עד 3 מיליון תאים לבקבוק T25 ב 10 מיליליטר של מדיה תרבותית. החלף חצי מדיית התרבות כל שלושה ימים.
השתמש בינוני cryopreservation זמין מסחרית כדי להקפיא את התאים. מעבירים את הנוירוספרות לצינור של 50 מיליליטר ומאפשרים לכדורים להתיישב בתחתית. השתמש 200 או 1000 טיפ פיפטה microliter להעביר את הנוירוספרות הגדולות לצינור חדש 50 מיליליטר לפני המעבר.
צנטריפוגה נוירוספרות הנותרות ב 300 עד 400 פעמים g במשך שלוש דקות בזהירות להסיר את supernatant. תעבדו עד אלף כדורים במיליליטר אחד של ריג'נט של הקפאה ותעבירו אותו לצינור קריו. לאחסן את הצינור לילה במינוס 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר אותו חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
כדי למדוד תפוגה עצבית, פתח את התמונה בפיג'י ובחר נתח, כלים ומנהל ההשקעות. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הסמל החמישי בשורת הכלים ישר ולעבור לקו ביד חופשית. לחלופין, לחץ פעמיים על אותו סמל כדי לשנות את רוחב הקו ל- 10.
לאחר מכן עקבו אחר הנוריט הארוך ביותר שמתחיל ליד גוף התא ומתרחב לקצה. הקש Control ו- T ולאחר מכן F כדי להוסיף את המדידה למנהל ההשקעות ולהדגיש את הנוירון הנמדד. בחר את כל המספרים בהו על ההשקעה.
לחץ על מדידה, ולאחר מכן להעתיק ולהדביק את המידות לתוך גיליון אלקטרוני. כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של תאים המסווים, לחץ על הסמל הרביעי בסרגל הכלים בחירות ביד חופשית וצייר את צורת התא. לחץ על נתח והגדר מידות.
לאחר מכן ודאו שאזור, ערך אפור ממוצע, ערך אפור מרבי דק וצפיפות משולבת נבחרו. לחץ על נתח ולמדוד. בחר את האזור לצד התא כריקע.
ולאחר מכן לחץ על לנתח ולמדוד. בחר את כל הנתונים למדוד ולהעתיק, להדביק אותו לתוך גיליון אלקטרוני. כדי לצפות את הצלחת להוסיף 30 microliters של פולי-L-ליסין לתוך כל באר של צלחת 384 היטב דגירה הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
לשטוף אותו פעמיים עם PBS ולתת לו להתייבש במשך כ 30 דקות. מוסיפים 30 מיקרוליטרים של למינין לכל באר, ואז דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. חזור על שטיפות עם PBS ולהמשיך עם ציפוי התאים.
הוסף 20, 000 נוירוספרות תא יחיד ב 25 microliters של מדיה ההתברות לכל באר של צלחת 384 באר הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים. נדרשים מיומנויות צינורות דיוק גבוהות לציפוי המספר המדויק של נוירוספרות שכולן מופרדות לתאים בודדים. לכן, ההבהרה של הנוירוספרות לנוירונים לפני ציפוי מומלץ להשיג תוצאות לשחזור יותר.
לאחר הדגירה, להוסיף חמישה microliters של תרכובת הבדיקה לכל באר בשש פעמים את הריכוז הרצוי. ו דגירה התאים לעוד 24 שעות. כדי לבצע את החיבור הכדאיות התאית, להוסיף 30 microliters של reagent זוהר לכל באר.
ולהשאיר את הצלחת על שייקר לשתי דקות. צנטריפוגה הצלחת ב 300 עד 400 פעמים גרם במשך 30 שניות, ולאחר מכן להחגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, להגן עליו מפני אור. לאחר הדגירה, למדוד את זוהר על קורא מיקרופלסטיק.
נוירונים נגזר תא עצבי אנושי שימשו כדי לבחון את ההשפעה של מעכבי HDAC כמו תרכובות אפיגניות מולקולה קטנה להרחבת neurites ואת היכולת הנוירוגנית הבאים של תרכובות מולקולות קטנות. neurotoxicity של מעכבי HDAC הוערך גם לאחר התבהרה התאים העוריים העצביים ב 384-well צלחות, מראה את הפוטנציאל לשנות את קנה המידה של הפרוטוקול עבור מספר גבוה יותר של תרכובות. במחקר אחר, מדידה של עוצמת פלואורסצנטיות התא העצבי שימש לכמת את השפע של היסטון H4 ליסטין חמש אצטילציה כסמן histone לאחר טיפול נוירונים עם תרכובות משנה אפיגנטי.
בנוסף, פרוטוקול זה שימש כדי לדמיין חלבון טרום סינפטי, סינפטופיצין, כדי לבדוק השפעות סינפטוגניות אפשריות של תרכובות מולקולה קטנה. בשיטה המוצגת, ניתן למדוד באופן אמין מספר נויריטים, עוצמה, אורך ורוחב, יחד עם מאפיינים סינפטיים, כולל שינויי חלבון לפני ופוסט סינפטית.
