Das vorgestellte Protokoll zur Beschreibung des Neuriten-Auswuchs-Assays, der für die menschliche Biologie und die Neurotoxizitätsbewertung einer kleinen Molekül-Verbindungen von großer Bedeutung ist. Hohes Translationspotenzial und physiologische Relevanz menschlicher neuronaler Vorläuferzellen als primäres menschliches Zellmodell bieten einen erheblichen Vorteil im neuritrischen Antik-Entdeckungsscreening und der Neurotoxizitätsbewertung. Unter Verwendung des vorgestellten Protokolls können humaninduzierte pluripotente Stammzell und menschliche embryonale Stammzellen-abgeleitete Neuronen auch als alternative Zellquellen für den Neuriten-Auswuchs-Assay und die Neurotoxizitätsbewertung verwendet werden.
Beginnen Sie mit dem Sammeln der Medien mit schwimmenden Neurosphären und übertragen Sie es auf eine 50 Milliliter konische Röhre. Zentrifugieren Sie das Rohr drei Minuten lang bei 300 bis 400 mal g. Dann den Überstand vorsichtig ansaugen.
und setzen Sie die Kugeln in 500 Mikroliter aufgetauten Zelldissoziationsreagenz wieder auf. Die Kugeln bei 37 Grad Celsius für fünf bis 15 Minuten bebrüten. Dann fünf bis zehn Milliliter vorgewärmter Kulturmedien hinzufügen und das Rohr bei 300 bis 400 mal g für fünf Minuten zentrifugieren, um die Neurosphären zu sedimentieren.
Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie zwei Milliliter kultureller Medien hinzu, die mit einer 1000-Mikroliter-Pipette auf und ab pfeifen, bis die Neurosphären eine Einzelzellsuspension bilden. Nach dem Zählen der Zellen, fügen Sie zwei bis 3 Millionen Zellen zu einem T25-Kolben in 10 Milliliter Kulturmedien. Ersetzen Sie alle drei Tage die Hälfte der Kulturmedien.
Verwenden Sie handelsübliche Kryokonservierungsmedium, um die Zellen einzufrieren. Übertragen Sie die Neurosphären in eine 50-Milliliter-Röhre und lassen Sie die Kugeln am Boden absetzen. Verwenden Sie eine 200 oder 1000 Mikroliter Pipettenspitze, um die großen Neurosphären auf eine neue 50-Milliliter-Röhre zu übertragen, bevor Sie passieren.
Zentrifugieren Sie die verbleibenden Neurosphären drei Minuten lang bei 300 bis 400 mal g und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Bis zu tausend Kugeln in einem Milliliter Kryokonservierungsreagenz wieder aufsetzen und in ein Kryorohr übertragen. Lagern Sie die Röhre über Nacht bei minus 80 Grad Celsius, und bewegen Sie sie dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff.
Um das neuronale Wachstum zu messen, öffnen Sie das Bild in Fidschi und wählen Sie Analysieren, Tools und ROI-Manager aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das fünfte Symbol in der Symbolleiste Gerade und wechseln Sie zu Freehand Line. Alternativ doppelklicken Sie auf dasselbe Symbol, um die Linienbreite auf 10 zu ändern.
Dann verfolgen Sie die längste Neurit, die in der Nähe des Zellkörpers beginnt und sich bis zur Spitze erstreckt. Drücken Sie Control und T dann F, um die Messung zum ROI Manager hinzuzufügen und das gemessene Neuron hervorzuheben. Wählen Sie alle Zahlen im ROI aus.
Klicken Sie auf Messen, kopieren Sie die Messungen und fügen Sie sie in eine Kalkulationstabelle ein. Um die Fluoreszenzintensität von beschrifteten Zellen zu messen, klicken Sie auf das vierte Symbol in der Symbolleiste Freihandauswahl und zeichnen Sie die Form der Zelle. Klicken Sie auf Analysieren und Festlegen von Messungen.
Stellen Sie dann sicher, dass Bereich, mittlerer Grauwert, mittlerer maximaler Grauwert und integrierte Dichte ausgewählt sind. Klicken Sie auf Analysieren und Messen. Wählen Sie den Bereich neben der Zelle als Hintergrund aus.
Klicken Sie dann auf Analysieren und Messen. Wählen Sie alle Messdaten aus und kopieren Sie sie, fügen Sie sie in eine Kalkulationstabelle ein. Um die Platte zu beschichten, fügen Sie 30 Mikroliter Poly-L-Lysin in jeden Brunnen einer 384-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Zweimal mit PBS waschen und ca. 30 Minuten trocknen lassen. Fügen Sie 30 Mikroliter Laminin zu jedem Brunnen, dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Wiederholen Sie die Wässer mit PBS und fahren Sie mit der Beschichtung der Zellen fort.
Fügen Sie 20.000 Einzelzell-Neurosphären in 25 Mikroliter Differenzierungsmedien zu jedem Brunnen der 384-Well-Platte hinzu und brüten Sie die Platte fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius an. Für die exakte Anzahl von Neurosphären, die alle in einzelne Zellen getrennt sind, sind hochpräzise Pipettierfähigkeiten erforderlich. Daher wird empfohlen, die Neurosphären vor der Beschichtung in Neuronen zu differenzieren, um reproduzierbarere Ergebnisse zu erzielen.
Nach der Inkubation fünf Mikroliter Testverbindung zu jedem Brunnen bei sechsfacher der gewünschten Konzentration hinzufügen. Und die Zellen für weitere 24 Stunden inkubieren. Um den Zelllebensfähigkeitsaufsatz durchzuführen, fügen Sie jedem Brunnen 30 Mikroliter Lumineszenzreagenz hinzu.
Und lassen Sie den Teller auf einem Shaker für zwei Minuten. Zentrifugieren Sie die Platte 30 Sekunden lang bei 300 bis 400 mal g, und inkubieren Sie die Platte dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und schützen Sie sie vor Licht. Messen Sie nach der Inkubation die Lumineszenz auf einem Mikroplattenleser.
Die menschlichen neuronalen Vorläuferzellen-abgeleiteten Neuronen wurden verwendet, um die Wirkung von HDAC-Inhibitoren als kleine Molekül-epigene Verbindungen für die Erweiterung von Neuriten und die anschließende neurogene Fähigkeit kleiner Molekülverbindungen zu untersuchen. Die Neurotoxizität der HDAC-Inhibitoren wurde auch nach der Differenzierung der neuronalen Vorläuferzellen in 384-Well-Platten bewertet, was das Potenzial zeigt, das Protokoll für eine höhere Anzahl von Verbindungen zu skalieren. In einer anderen Studie wurde die Messung der fluoreszenzenden Neuronen-Fluoreszenzintensität verwendet, um die Fülle von Histon H4-Lysin-Fünf-Acetylierung als Histonmarker nach der Behandlung der Neuronen mit epigenetischen Modifikatorverbindungen zu quantifizieren.
Zusätzlich wurde dieses Protokoll verwendet, um ein präsynaptisches Protein, Synaptophysin, zu visualisieren, um auf mögliche synaptogene Wirkungen von kleinen Molekülverbindungen zu überprüfen. Mit der vorgestellten Methode konnten Neuritenanzahl, Intensität, Länge und Breite zusammen mit synaptischen Eigenschaften, einschließlich prä- und postsynaptischer Proteinmodifikationen, zuverlässig gemessen werden.
