Il protocollo presentato che descrive il test di crescita della neurite che è altamente rilevante per la biologia umana e la valutazione della neurotossicità di una piccola molecola composti. L'elevato potenziale trasandato e la rilevanza fisiologica delle cellule progenitrici neurali umane come modello primario di cellule umane offrono un notevole vantaggio nello screening della scoperta di farmaci correlato alla crescita della neurite e nella valutazione della neurotossicità. Utilizzando il protocollo presentato, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e i neuroni derivati dalle cellule staminali embrionali umane possono anche essere utilizzati come fonti cellulari alternative per il test di crescita della neurite e la valutazione della neurotossicità.
Inizia raccogliendo i media con neurosfere galleggianti e trasferendoli in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il tubo da 300 a 400 volte g per tre minuti. Quindi aspirare con cura il supernatante.
e rimospendare le sfere in 500 microlitri di reagente di dissociazione cellulare scongelato. Incubare le sfere a 37 gradi Celsius per cinque-15 minuti. Quindi aggiungere da cinque a 10 millilitri di mezzi di coltura pre-riscaldati e centrifugare il tubo a 300-400 volte g per cinque minuti per sedimentare le neurosfere.
Aspirare il supernatante e aggiungere due millilitri di mezzi culturali che si tubano su e giù con una pipetta da 1000 microlitri fino a quando le neurosfere formano una singola sospensione cellulare. Dopo aver contato le cellule, aggiungere da due a 3 milioni di cellule a un pallone T25 in 10 millilitri di mezzi di coltura. Sostituisci metà dei supporti culturali ogni tre giorni.
Utilizzare il mezzo di crioconservazione disponibile in commercio per congelare le cellule. Trasferire le neurosfere in un tubo da 50 millilitri e permettere alle sfere di depositarsi sul fondo. Utilizzare una punta di pipetta da 200 o 1000 microliter per trasferire le grandi neurosfere in un nuovo tubo da 50 millilitri prima della passatura.
Centrifugare le restanti neurosfere a 300-400 volte g per tre minuti e rimuovere con cura il supernatante. Resuspend fino a mille sfere in un millilitro di reagente di crioconservazione e trasferirlo in un tubo criogenico. Conservare il tubo durante la notte a meno 80 gradi Celsius, quindi spostarlo in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine.
Per misurare la crescita neuronale, apri l'immagine nelle Fiji e seleziona Analizza, Strumenti e ROI Manager. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla quinta icona nella barra degli strumenti Dritto e passare a Linea a mano libera. Facoltativamente, fare doppio clic sulla stessa icona per impostare la larghezza della linea su 10.
Quindi traccia la neurite più lunga che inizia vicino al corpo cellulare e si estende fino alla punta. Premere Ctrl e T quindi F per aggiungere la misurazione al ROI Manager ed evidenziare il neurone misurato. Selezionare tutti i numeri nel ROI.
Fare clic su Misura, quindi copiare e incollare le misure in un foglio di calcolo. Per misurare l'intensità di fluorescenza delle celle etichettate, fare clic sulla quarta icona nella barra degli strumenti Selezioni a mano libera e disegnare la forma della cella. Fate clic su Analizza (Analyze) e impostate misure (Set Measurements).
Assicurarsi quindi che siano selezionati Area, Valore grigio medio, Valore grigio minimo minimo e Densità integrata. Fare clic su Analizza e misura. Selezionare l'area accanto alla cella come sfondo.
Quindi fare clic su analizza e misura. Selezionare tutti i dati di misura e copiarli, incollarli in un foglio di calcolo. Per rivestire la piastra aggiungere 30 microlitri di poli-L-lisina in ogni pozzo di una piastra da 384 po 'e incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora.
Lavarlo due volte con PBS e lasciarlo asciugare per circa 30 minuti. Aggiungere 30 microlitri di laminina ad ogni pozzo, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due ore. Ripetere i lavaggi con PBS e procedere con la placcatura delle cellule.
Aggiungere 20.000 neurosfere a singola cellula in 25 microlitri di mezzi di differenziazione ad ogni pozzo della piastra da 384 po 'e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Sono necessarie abilità di pipettazione ad alta precisione per placcare il numero esatto di neurosfere che sono tutte segregate in singole cellule. Pertanto, si raccomanda di differenziare le neurosfere in neuroni prima della placcatura per ottenere risultati più riproducibili.
Dopo l'incubazione, aggiungere cinque microlitri di composto di prova ad ogni pozzo a sei volte la concentrazione desiderata. E incubare le cellule per altre 24 ore. Per eseguire il saggio di vitalità cellulare, aggiungere 30 microlitri di reagente luminescente ad ogni pozzo.
E lasciare il piatto su uno shaker per due minuti. Centrifugare la piastra a 300-400 volte g per 30 secondi, quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti, proteggendola dalla luce. Dopo l'incubazione, misurare la luminescenza su un lettore di micropiatte.
I neuroni derivati dalle cellule progenitrici neurali umane sono stati utilizzati per esaminare l'effetto degli inibitori dell'HDAC come composti epigenici a piccole molecole per l'estensione dei neuriti e la successiva capacità neurogenica dei composti delle piccole molecole. La neurotossicità degli inibitori dell'HDAC è stata valutata anche dopo aver differenziato le cellule progenitrici neurali in piastre a 384 pozzi, mostrando il potenziale per scalare il protocollo per un numero maggiore di composti. In uno studio diverso, la misurazione dell'intensità della fluorescenza cellulare neuronale è stata utilizzata per quantificare l'abbondanza di lisina H4 istonale cinque acetilazione come marcatore istonale dopo aver trattato i neuroni con composti modificatori epigenetici.
Inoltre, questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare una proteina pre-sinaptica, la sinaptofisina, per verificare la presenza di possibili effetti sinaptogenici di composti di piccole molecole. Usando il metodo presentato, il numero, l'intensità, la lunghezza e la larghezza dei neuriti, insieme alle caratteristiche sinaptiche, incluse le modifiche delle proteine pre e post-sinaptiche, potrebbero essere misurati in modo affidabile.
