작은 분자 화합물의 인간 생물학 및 신경 독성 평가와 매우 관련이 있는 neurite 아웃growth 분석기를 기술하는 제시된 프로토콜. 1차 인간 세포 모델로서 인간 신경 전구 세포의 높은 번역 잠재력 및 생리적 관련성은 중성염 아웃성장 관련 약물 발견 선별 및 신경 독성 평가에서 상당한 이점을 제공한다. 제시된 프로토콜을 활용하여, 인간 유도만능 줄기 세포 및 인간 배아 줄기 세포 유래 뉴런은 또한 중성자 내성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 대체 세포 공급원으로 사용될 수 있다.
부동 신경구로 미디어를 수집하고 50 밀리리터 원추형 튜브로 전송하는 것으로 시작합니다. 3 분 동안 300 ~ 400 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다. 그런 다음 신중하게 슈퍼 나티를 흡인.
해동된 세포 해리 시약의 500 마이크로리터에서 구를 다시 중단한다. 5~15분 동안 37도에서 구체를 배양합니다. 그런 다음 미리 데운 배양 배지의 5~10밀리리터를 추가하고 신경구를 퇴적시키기 위해 5분 동안 300~400배 g의 원심분리기를 추가합니다.
슈퍼나티를 흡인하고 신경구가 단일 세포 현탁액을 형성할 때까지 1000 마이크로리터 파이펫으로 위아래로 파이프를 하는 문화 매체의 2밀리리터를 추가합니다. 세포를 계산한 후, 배양 매체의 10 밀리리터에서 T25 플라스크에 2~300만 개의 세포를 추가합니다. 3일마다 문화 미디어의 절반을 교체하십시오.
시판되는 냉동 보존 매체를 사용하여 세포를 동결하십시오. 신경구를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 구체가 바닥에 정착할 수 있도록 합니다. 200 또는 1000 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 큰 신경구를 새로운 50 밀리리터 튜브로 전달한 후 통과하십시오.
3 분 동안 300 ~ 400 배 g에서 나머지 신경 구체를 원심 분리하고 조심스럽게 상체를 제거합니다. 냉동 보존 시약의 1 밀리리터에 천 구까지 다시 중단하고 냉동 튜브로 전송합니다. 하룻밤 동안 튜브를 영하 80도에서 보관한 다음 장기 보관을 위해 액체 질소로 이동합니다.
신경 성장을 측정하려면 피지에서 이미지를 열고 분석, 도구 및 ROI 관리자를 선택합니다. 도구 막대 직선의 다섯 번째 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 Freehand 선으로 전환합니다. 선택적으로 동일한 아이콘을 두 번 클릭하여 줄 너비를 10으로 변경합니다.
그런 다음 세포 체 근처에서 시작하여 팁으로 확장되는 가장 긴 중성염을 추적합니다. 제어 및 T를 눌러 ROI 관리자에 측정을 추가하고 측정된 뉴런을 강조 표시합니다. ROI의 모든 숫자를 선택합니다.
측정값을 클릭한 다음 측정값을 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다. 레이블이 표시된 셀의 형광 강도를 측정하려면 도구 모음 Freehand 선택에서 네 번째 아이콘을 클릭하고 셀모양을 그립니다. 측정 분석 및 설정을 클릭합니다.
그런 다음 영역, 평균 회색 값, 최소 최대 회색 값 및 통합 밀도를 선택했는지 확인합니다. 분석 및 측정을 클릭합니다. 셀 옆 영역을 배경으로 선택합니다.
그런 다음 분석하고 측정합니다. 모든 측정 데이터를 선택하고 복사하여 스프레드시트에 붙여 넣습니다. 플레이트를 코팅하려면 384웰 플레이트의 각 웰에 폴리 L-리신 30 마이크로리터를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.
PBS로 두 번 씻고 약 30 분 동안 건조시키십시오. 각 우물에 30 마이크로리터를 추가한 다음 2시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. PBS로 세동을 반복하고 세포를 도금으로 진행합니다.
384웰 플레이트의 각 웰에 25마이크로리터의 분화 매체에 20, 000개의 단일 세포 신경구를 추가하고 5일 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양한다. 높은 정밀 파이펫 팅 기술은 모두 단일 세포로 분리되는 신경 구체의 정확한 수를 도금하는 데 필요합니다. 따라서, 도금 하기 전에 신경 구체를 뉴런으로 분화 하는 것은 더 재현 가능한 결과 달성 하는 것이 좋습니다.
인큐베이션 후, 원하는 농도의 6배에 달하는 5개의 마이크로리터를 각 웰에 첨가한다. 그리고 다른 24 시간 동안 세포를 배양. 세포 생존성 에세이를 수행하려면 각 웰에 발광 시약 30 마이크로 리터를 추가하십시오.
그리고 2 분 동안 셰이커에 접시를 둡니다. 플레이트를 300~400회 g에서 30초 간 원심분리한 다음 실온에서 10분 동안 플레이트를 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 잠복 후 마이크로 플레이트 판독기의 발광을 측정합니다.
인간 신경 전구 세포 유래 뉴런은 작은 분자 화합물의 확장과 뉴라이트의 연장을 위한 작은 분자 에피겐성 화합물로서 HDAC 억제제의 효과를 검사하는 데 사용되었다. HDAC 억제제의 신경 독성은 또한 384-웰 플레이트에서 신경 전구 세포를 분화한 후에 평가되었으며, 더 많은 수의 화합물에 대한 프로토콜을 확장할 수 있는 가능성을 나타냈다. 다른 연구에서는, 뉴런 세포 형광 강도의 측정은 후성 유전학 수정제 화합물로 뉴런을 치료 한 후 히스톤 마커로 히스톤 H4 lysine 5 아세틸화의 풍부를 정량화하는 데 사용되었다.
추가적으로, 이 프로토콜은 작은 분자 화합물의 가능한 시냅토제 효과를 확인하기 위해 사전 시냅스 단백질, 시냅토피신을 시각화하는 데 사용되었습니다. 제시된 방법을 사용하여, 신경염 수, 강도, 길이 및 폭, 시냅스 특성, 사전 및 시냅스 후 단백질 수정을 포함하는 안정적으로 측정될 수 있다.
