O protocolo apresentado descrevendo o ensaio de crescimento de neurite que é altamente relevante para a biologia humana e a avaliação neurotoxicidade de um pequeno composto de moléculas. Alto potencial translacional e relevância fisiológica das células progenitoras neurais humanas como modelo primário de células humanas oferecem uma vantagem considerável na triagem de descoberta de drogas relacionada ao crescimento de neurite e avaliação da neurotoxicidade. Utilizando o protocolo apresentado, células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem e neurônios derivados de células-tronco embrionárias humanas também podem ser usados como fontes celulares alternativas para o ensaio de crescimento de neurite e avaliação da neurotoxicidade.
Comece coletando a mídia com neuroesferas flutuantes e transferindo-a para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar o tubo a 300 a 400 vezes g por três minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o supernaspe.
e resuspensar as esferas em 500 microlitros de reagente de dissociação celular descongelada. Incubar as esferas a 37 graus Celsius por cinco a 15 minutos. Em seguida, adicione cinco a 10 mililitros de mídia de cultura pré-aquecida e centrifugar o tubo a 300 a 400 vezes g por cinco minutos para sedimentar as neurosferas.
Aspire o supernascer e adicione dois mililitros de mídia cultural subindo e descendo com uma pipeta de 1000 microliteres até que as neurosferas formem uma única suspensão celular. Depois de contar as células, adicione de 2 a 3 milhões de células a um frasco T25 em 10 mililitros de mídia cultural. Substitua metade da mídia cultural a cada três dias.
Use o meio de criopreservação disponível comercialmente para congelar as células. Transfira as neurosferas para um tubo de 50 mililitros e permita que as esferas se instalem na parte inferior. Use uma dica de pipeta de 200 ou 1000 microliter para transferir as grandes neurosferas para um novo tubo de 50 mililitros antes da passagem.
Centrifugar as neuroesferas restantes a 300 a 400 vezes g por três minutos e remover cuidadosamente o supernatante. Resuspend até mil esferas em um mililitro de reagente criopreservação e transferi-lo para um tubo criogênico. Armazene o tubo durante a noite a menos 80 graus Celsius, depois mova-o para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
Para medir o crescimento neuronal, abra a imagem em Fiji e selecione Analisar, Ferramentas e Gerenciador de ROI. Clique com o botão direito do mouse no quinto ícone na barra de ferramentas Reta e mude para Linha Freehand. Opcionalmente, clique duas vezes no mesmo ícone para alterar a largura da linha para 10.
Em seguida, rastreie o neurite mais longo começando perto do corpo celular e estendendo-se até a ponta. Pressione o Controle e o T, em seguida, F para adicionar a medição ao Gerenciador de ROI e destacar o neurônio medido. Selecione todos os números no ROI.
Clique em Medir e copie e cole as medidas em uma planilha. Para medir a intensidade da fluorescência das células rotuladas, clique no quarto ícone na barra de ferramentas Freehand Selections e desenhe a forma da célula. Clique em Analisar e Definir Medidas.
Em seguida, certifique-se de que área, valor cinza médio, valor cinza mínimo min e densidade integrada são selecionados. Clique em Analisar e medir. Selecione a região ao lado da célula como plano de fundo.
E, em seguida, clique em analisar e medir. Selecione todos os dados de medida e copie-os e cole-os em uma planilha. Para revestir a placa adicione 30 microliters de poli-L-lysine em cada poço de uma placa de 384 poços e incubar a placa em temperatura ambiente por uma hora.
Lave-o duas vezes com PBS e deixe secar por aproximadamente 30 minutos. Adicione 30 microliters de laminina a cada poço, em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por duas horas. Repita as lavagens com PBS e prossiga com o revestimento das células.
Adicione 20.000 neurosferas de células únicas em 25 microliters de mídia de diferenciação a cada poço da placa de 384 poços e incubar a placa a 37 graus Celsius por cinco dias. Habilidades de pipetação de precisão hight são necessárias para emplacamento do número exato de neuroesferas que é tudo segregado em células únicas. Portanto, diferenciar as neurosferas em neurônios antes do revestimento é recomendado para alcançar resultados mais reprodutíveis.
Após a incubação, adicione cinco microliters de composto de teste a cada poço em seis vezes a concentração desejada. E incubar as células por mais 24 horas. Para realizar o ensaio de viabilidade celular, adicione 30 microliters de reagente luminescente a cada poço.
E deixe o prato em um agitador por dois minutos. Centrifugar a placa a 300 a 400 vezes g durante 30 segundos e, em seguida, incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos, protegendo-a da luz. Após a incubação, meça a luminescência em um leitor de microplaca.
Os neurônios derivados de células progenitoras neurais humanos foram usados para examinar o efeito dos inibidores do HDAC como compostos epigênicos de moléculas pequenas para a extensão de neurites e subsequente capacidade neurogênica de compostos de pequenas moléculas. A neurotoxicidade dos inibidores do HDAC também foi avaliada após diferenciar as células progenitoras neurais em placas de 384 poços, mostrando o potencial de escalar o protocolo para um maior número de compostos. Em um estudo diferente, a medição da intensidade de fluorescência celular neuronal foi usada para quantificar a abundância de histone H4 lysine cinco acetilação como marcador de histona depois de tratar os neurônios com compostos de modificadores epigenéticos.
Além disso, este protocolo tem sido usado para visualizar uma proteína pré-sináptica, a sináptua, para verificar possíveis efeitos sinaptáticos de pequenos compostos de moléculas. Utilizando o método apresentado, o número de neurites, intensidade, comprimento e largura, juntamente com características sinápticas, incluindo modificações proteicas pré e pós-sinápticas poderiam ser medidos de forma confiável.
