使用阿基-树脂辅助捕获检测蛋白质S-囊肿

丙烯酸辅助捕获或Acyl-RAC是一种敏感可靠的方法，可用于检测各种生物样品中的蛋白质S-环化。该协议绕过代谢标签和放射性标签的一些限制，并允许同时检测多种蛋白质的S-细胞化。不仅活细胞，而且原组织和冷冻样品。

S-二聚变可以调节各种细胞过程，如蛋白质贩运、血浆膜靶向、信号转导、铁传输和蛋白质-蛋白质相互作用。对于每个实验，使用新鲜准备好的羟基胺溶液，并经过仔细调整的pH值，以确保硫酯键的高效和特定的裂解非常重要。通过演示这种方法，它对于氯仿、甲醇沉淀等步骤至关重要。

在此步骤中获得的煎饼形状颗粒应非常小心处理。它可以是脆弱的，在步骤期间样品的部分损失可能导致样品恢复不均匀。演示这个程序的将是萨凡纳·韦斯特，一个来自我们实验室的研究生。

要获得细胞解酸，请将感兴趣的细胞收集到锥形离心管中。通过离心去除任何细胞碎片。在5毫升PBS中清洗颗粒。

并立即将细胞重新用于600微升新鲜准备的解液缓冲液中。在热摇床中，以每分钟 1，500 转的速度搅拌样品，在 4 摄氏度下搅拌 30 分钟。在通过离心清除溶糖、颗粒洗涤剂和可溶性材料之前。

离心结束时，在冰上预冷却的1.5毫升微离心管中收集清除的利沙酸盐。并执行布拉德福德或双辛辛酸测定，根据标准方案估计蛋白质浓度。加入甲醇和氯仿，以2:1的比例进行口水。

严格摇动，形成均匀悬浮液，并离心样品，在水相和有机相之间的界面收集蛋白质颗粒。倾斜管，使用针头或凝胶加载尖端吸气尽可能多的溶剂。空气干燥蛋白质颗粒几分钟。

在轻轻地将管内装物与600微升甲醇混合之前，注意不要分解颗粒。小心去除甲醇洗涤后，将蛋白质颗粒干燥在长凳上约五分钟。接下来，将蛋白质颗粒重新在200微升2SHB缓冲液中。

在热摇床中，温度为42摄氏度，每分钟旋转1500圈。当颗粒溶解时，在2SHB中加入200微升0.2%MMTS。在42摄氏度下孵育蛋白质15分钟，在热摇床中每分钟孵育1500转。

在孵育结束时，进行3:4氯仿甲醇沉淀，如证明。要去除MMTS，请将颗粒溶解在100微升新鲜2SHB缓冲液中，并进行涡旋。每次沉淀后，用300微升缓冲液 A 稀释样品。

最终沉淀后，将样品溶解在2SHB缓冲液的200微升中，用240微升缓冲液进行稀释。再次测量蛋白质浓度，并留出每个样品中的40微升作为输入控制。将样品分成两个相等的体积 200 微升。并标记管为加羟基胺和减去羟基胺。

将 50 微升新鲜准备好的中性二摩尔羟基胺加入 400 毫摩尔的最终浓度添加到加羟基胺管中。和50微升中性二摩尔氯化钠对负对，一个负羟基胺管。然后在每个管中加入30微升的TS珠浆。

在室温下旋转管子一到两个小时。在孵化结束时，用缓冲液 A 中的 1%SDS 清洗珠子四次，以去除残留的羟基胺。最后一次洗涤后，用三个温和的一分钟微离心洗洗所有珠子样品。

小心吸气的超自然剂和重新暂停珠子在500微升1%SDS在缓冲器 A每次洗涤。上次洗涤后，轻轻旋转珠子，如证明。吸气尽可能多的上一道，而不打扰珠子。

为了从珠子中回收蛋白质，将50微升4%SDS样品缓冲液加入每个管中，并在80摄氏度和每分钟1500转的热摇床中孵育样品15分钟。在孵育结束时，让样品冷却后离心，以完全颗粒珠子。然后使用凝胶加载尖端将洗样蛋白转移到新的 1.5 毫升管中。

并在SDS-PAGE凝胶上运行样品，通过西方印迹分析感兴趣的蛋白质的S-acylation。酪氨酸激酶Lck可以在用中性二摩尔羟基胺处理的乳酸盐中检测。切开半胱氨酸残留物和脂肪酸莫伊蒂之间的硫酯键。

脱衣和与抗体对蛋白质Fyn和LAT的重新剥离表明，丙烯酸树脂辅助捕获测定可用于同时分析多种蛋白质的S-同化。此外，在原小鼠飞溅细胞中，可以很容易地检测到Lck、Fyn和LAT的S-acylation。指示这种修饰在两个物种之间保存。

除了识别新型S-甲基化蛋白外，该方法还可用于评估不同生物条件下蛋白质S-甲基化的变化。新识别的S-甲基化蛋白的数量大大增加后，双重增加意味着快速和可靠的技术，如Acyl-RAC。除了识别新型S-甲基化蛋白外，该方法还可用于评估不同生物条件下蛋白质S-甲基化的变化。