وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل كانساس INBRE، P20GM103418 إلى لي وزينوفييفا وR35GM124828 إلى زينوفييفا. نشكر مين هان لتقاسم بسخاء المضادة AIN-1 الأجسام المضادة. تم توفير بعض السلالات المستخدمة في سياق هذا العمل من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) ، بتمويل من مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440).

1. جمع عينة دودة
<ol><li>مرحلة مختلطة البذور أومتزامنة 13 الديدان على لوحات صلبة NGM في درجة الحرارة المطلوبة والسماح للديدان أن تنمو حتى المرحلة المرجوة. للحصول على نمو وصيانة C. elegans الأساسي، يرجى الاطلاع على Stiernagle وآخرون وPorta-de-la-Rivaوآخرون.</li>
	<li>جمع الديدان في أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل عن طريق غسل لوحات دودة مع العازلة M9.</li>
	<li>بيليه الديدان عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2 دقيقة والتخلص من supernatant. ملاحظة: حجم بيليه الدودة لإعداد استخراج ما بين 100 ميكرولتر و 500 ميكرولتر. ويوصى بيليه 300 ميكرولتر من الديدان معبأة لتجارب المناعة المصب وعادة ما تسفر عن ~ 4.5 ملغ من البروتين الكلي، في حين أن بيليه 500 ميكرولتر سوف تسفر عن ~ 7.5 ملغ من البروتين الكلي.</li>
	<li>قم بإجراء عمليات غسل إضافية من 3 إلى 5 باستخدام المخزن المؤقت M9 (انظر الجدول 1)أو حتى لا يعود الناسخة الفائقة غائمة.</li>
	<li>إجراء غسل نهائي واحد مع DDH2O.</li>
	<li>نقل بيليه دودة فضفاضة إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل وتدور إلى أسفل في 400 × ز في RT لمدة 2 دقيقة. تجاهل ما تبقى من الناطقة للحصول على بيليه دودة معبأة والمضي قدما لاستخراج إعداد. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. الكريات دودة قد تكون فلاش المجمدة في النيتروجين السائل على الفور وتخزينها في -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل. يرجى ملاحظة أنه لا يمكن إذابة الكريات الدودة إلا مرة واحدة ولا يمكن إعادة تجميدها.</li>
</ol>2. استخراج إعداد بيليه دودة
ملاحظة: يجب إجراء إعداد المستخلص على الجليد أو عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
<ol><li>إذا تجمدت، إذابة دودة بيليه على الجليد. ملاحظة: إذا لم يتم الحصول على حجم الكريات دودة معبأة المطلوب من 300 ميكرولتر أثناء جمع العينة، يمكن الجمع بين الكريات أصغر متعددة حتى ما يكفي من المواد موجودة لمزيد من الاستخراج.</li>
	<li>إضافة حجم متساو من الجليد الباردة 2x تحلل العازلة (60 mM HEPES، درجة الحموضة = 7.4، 100 مللي متر كلوريد البوتاسيوم، 0.1٪ تريتون X، 4 M M كلوريد المغنيسيوم، 10٪ الجلسرين، 2 MDTT مع مثبط RNase، مثبط البروتيز، ومثبطات فوسفاتاز؛ انظر الجدول 1)ودوامة أو ماصة صعودا وهبوطا لخلط. تدور أنبوب (ق) إلى أسفل لجمع الخليط في الجزء السفلي من الأنبوب.</li>
	<li>نقل الخليط إلى أنبوب 1.5 مل RNase خالية تحتوي على الخرز المعدني (انظر جدول المواد)ووضع العينة في المتجانس مطحنة حبة (انظر جدول المواد) في 4 درجة مئوية. تأكد من أن يتم تشديد قبعات أنبوب والعينات متوازنة داخل المتجانس.</li>
	<li>تجانس العينة بأعلى سرعة (ضبط 12) لمدة 4 دقائق.</li>
	<li>قم بإزالة العينة من الخرز ووضعها في أنبوب طرد صغير جديد سعة 1.5 مل. بدلا من ذلك، يمكن استخدام مغناطيس مزود بالمتجانس لإزالة الخرز من العينة.</li>
	<li>تدور أسفل استخراج في 19،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية لتوضيح استخراج البروتين.</li>
	<li>نقل supernatant في أنبوب جديد 1.5 مل على الجليد، مع تجنب ترحيل الأبيض، عجل غائم أن يشكل على رأس العينة. العملاق هو الآن المقتطف الموضح. ملاحظة: حفظ 10 ميكرولتر من استخراج أوضح لتحديد تركيز البروتين الكلي.</li>
	<li>استخدام استخراج فورا للتجارب التالية أو فلاش تجميد استخراج في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية. ملاحظة: قد يكون البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين المستخلصات في درجة حرارة منخفضة للغاية (-80 درجة مئوية الفريزر أو النيتروجين السائل لمدة 6 أشهر تقريبا). يمكن إذابة المستخلصات المجمدة مرة واحدة ولا يمكن إعادة تجميدها.</li>
	<li>تحديد تركيز البروتين الكلي للاستخراج باستخدام مجموعة اختبار تركيز البروتين المتوافقة مع المنظفات (انظر جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.</li>
</ol>3. التكفير المناعي
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات التهيئة المناعية لإعداد المستخلص على الجليد أو عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. فمن المستحسن استخدام 2 ملغ من البروتين الكلي لكل مناعة. ومع ذلك، تم إجراء رئاسات مناعية ناجحة مع 0.8-1 ملغ من البروتين الكلي. استخدم دائما مستخلصات البروتين الطازجة أو المذابة حديثا. ويرد البروتوكول التالي لأداء التوفير المناعي من 2 ملغ من البروتين الكلي، أو تجربة واحدة مناعة. يمكن زيادة كمية الخرز والأجسام المضادة أو تقليلها وفقا لذلك لعينات متعددة أو إذا تم استخدام كمية مختلفة من مستخلص البروتين.
<ol><li>ضع أو إذابة مستخلص البروتين على الجليد. يمكن تخفيف العينة إلى 10 ملغم /مل أو 5 ملغم/مل مع عازل تحلل 1x بارد الجليد (انظر الجدول 1).</li>
	<li>Resuspend الخرز المغناطيسي عن طريق عكس ونقل 150 ميكرولتر من تعليق الخرز 50٪ في أنبوب 1.5 مل. ممغنطة الخرز على الجليد ضد موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة أو حتى الحل واضح. تجاهل الناتنات الفائق.</li>
	<li>قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي واغسل الخرز في مخزن تحلل 1x باستخدام مجلدين (أي 300 ميكرولتر) من ملاط الخرز. كرر غسل 2x لما مجموعه ثلاثة يغسل.</li>
	<li>Resuspend الخرز في 150 ميكرولتر من الجليد الباردة تحلل العازلة.</li>
	<li>نقل 75 ميكرولتر من الطين حبة إلى 2 ملغ من استخراج البروتين واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف. حفظ تعليق حبة المتبقية على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق. ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لتقليل ربط البروتين غير محددة إلى حبات أثناء خطوة المناعة.</li>
	<li>ضع الأنبوب مع عينة على الحامل المغناطيسي على الجليد لمدة دقيقة واحدة أو حتى يتم ممغنط الخرز بالكامل وتكون العينة واضحة. نقل supernatant إلى أنبوب 1.5 مل جديدة; لا تزعج الخرز. هذا هو ليسات البروتين المخلى مسبقا. حفظ 10٪ من العينة لتحليل لطخة الغربية.</li>
	<li>إضافة 20 ميكروغرام من تقارب الأجسام المضادة المنقى إلى lysate precleared واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف. ملاحظة: كمية الأجسام المضادة المستخدمة في التكفير المناعي محددة للأجسام المضادة والبروتين ويجب تحديدها تجريبيا لضمان فعالية المناعة للبروتين المستهدف.</li>
	<li>أضف المتبقية 75 ميكرولتر من تعليق الخرز مغسولة مسبقا (الخطوة 3.5) إلى خليط الأجسام المضادة / ليسات واحتضان لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية مع التحريض لطيف.</li>
	<li>ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي على الجليد لمدة دقيقة واحدة أو حتى يتم ممغنط الخرز بالكامل وتكون العينة واضحة. حفظ supernatant لتحليل لطخة الغربية (اختياري).</li>
	<li>غسل الخرز التي تحتوي على 3x 3x المناعي في 450 ميكرولتر من عازلة غسل (30 mM HEPES، درجة الحموضة = 7.4، 100 mM كلوريد البوتاسيوم، 0.1٪ تريتون X، 2 MM كلوريد المغنيسيوم، 10٪ الجلسرين، 1 mM DTT؛ انظر الجدول 1) على الجليد. ملاحظة: يمكن إجراء عمليات غسيل إضافية إذا كانت ظروف الغسيل أكثر صرامة مفضلة.</li>
	<li>Resuspend بيليه حبة في 20 ميكرولتر من 2x SDS / BME البروتين هلام تحميل العازلة (انظر جدول المواد)وdnature عن طريق الغليان في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل تحميل على هلام SDS-PAGE. بدلا من ذلك، يمكن تخزين عينات مشوهة في -20 درجة مئوية لعدة أشهر. ملاحظة: يمكن حفظ جزء من مناعة الخرز لعزل الحمض النووي الريبي المصب، إذا رغبت في ذلك.</li>
</ol>4. غرب كشف بقعة من عينات الملكية الفكرية
<ol><li>تحميل عينات IP على هلام SDS-PAGE (انظر جدول المواد). تجنب نقل الخرز عن طريق وضع أنابيب IP على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة قبل طموح العينة.</li>
	<li>تنفيذ النشاف الغربي15،16 والأجسام المضادةتلطيخ 16 مع التعديلات التالية : تمييع الأجسام المضادة ALG - 117 1:500 في 5 ٪ الحليب الجاف غير الدهني (NFDM) ؛ تمييع الأجسام المضادة HRPK-12 1:1,000 في 5٪ NFDM؛ وتمييع الأجسام المضادة AIN-118 1:10,000 في 5٪ NFDM. واستخدمت الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.</li>
	<li>الكشف عن النطاقات مع chemiluminescence القائم على HRP (انظر جدول المواد).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

C. elegans هو نموذج ممتاز لدراسة الأسئلة الأساسية في الخلية والجزيئية والبيولوجيا التنموية19. بالإضافة إلى قوتها كنظام نموذج وراثي ، فإن C. elegans قابلة للنهج الكيميائية الحيوية ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، التكفير المناعي للبروتين وفرط المناعة. إحدى العقبات المحتملة عند إجراء تجارب السهب المناعي هي نقص الأجسام المضادة الخاصة بالبروتينات ذات الاهتمام. إذا لم يتوفر أي جسم مضاد، يمكن توليد أجسام مضادة مخصصة متعددة النسيلة أو أحادية النسيلة. ومع ذلك ، سمحت الابتكارات الأخيرة في تكنولوجيا تحرير الجينوم للباحثين بإدخال الطفرات بسرعة أو وضع علامة على جينات C. elegans الذاتية20،21، مما يسهل الدراسات التي تكشف عن التفاعلات الوراثية والوظيفية والجسدية بين الجينات والبروتينات المشفرة. وعلى وجه التحديد، فإن وضع علامات بوساطة CRISPR/Cas9 لجينات سي إليغانس في الموضع الداخلي قد قلل من اعتماد تجارب التكسير المناعي على توافر الأجسام المضادة، مما جعل تجارب نقص المناعة المشتركة أكثر جدوى بكثير. C. يمكن وضع علامات على جينات elegans بمجموعة متنوعة من العلامات التي تتراوح بين علامات الفلورسنت مثل GFP أو mCherry إلى العلامات الصغيرة مثل FLAG و HA. الأجسام المضادة التي تعترف بهذه العلامات متاحة بسهولة تجاريا، مما يسهل دراسات التفاعلات البروتين البروتين عن طريق نهج السهونة المناعية.
ويمكن تنفيذ البروتوكول المقدم، المبين في الشكل 1،لعدد صغير من العينات أو توسيع نطاقه، مما يسمح بما يصل إلى 24 إعدادا للعينة في كل مرة. في حين أن التوصيفات الأولية للتفاعلات البروتين البروتين عن طريق المناعة وعادة ما تتم في خلفيات نوع البرية في ظل ظروف النمو العادية، ودراسات المتابعة تتطلب في كثير من الأحيان اختبار التفاعلات البروتين البروتين في مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية أو في ظل ظروف نمو مختلفة. القدرة على إعداد مقتطفات متعددة في وقت واحد يوفر الوقت، والأهم من ذلك، يضمن استخراج اتساق إعداد بين عينات مختلفة. هناك حاجة دائما إلى التحكم السلبي ، مع كون التحكم المثالي طفرة فارغة في الترميز الجيني للبروتين المناعي المثير للاهتمام (انظر الشكل 3 والشكل 4 على سبيل المثال).
يسمح هذا البروتوكول استخراج لإعداد استخراج البروتين السريع من عينات C. elegans وقابلة للمقارنة مع التجانس القائم على حبة الزركونيوم8. يمكن توسيع نطاق تجانس الخرز بشكل عام إلى عدة تحضيرات عينة متزامنة باستخدام مجموعة متنوعة من متجانسات مطحنة الخرز أو معدات مماثلة. بعض التجانس مطحنة حبة أكثر اقتصادا قد يقلل من عدد العينات التي يمكن معالجتها في وقت واحد، ومع ذلك. بدلا من ذلك، بروتوكول استخراج المقدمة متوافق مع إعداد استخراج dounce القائم، والذي يمثل بديلا اقتصاديا. في حين لم يتم اختبار متجانسات مطحنة حبة مختلفة، ومعظمها من المرجح أن تكون متوافقة مع هذا البروتوكول استخراج البروتين، طالما يتم تحقيق تعطيل كامل للعينات C. elegans.
كما هو معروض، هذا البروتوكول إعداد استخراج متوافق مع تجارب المصب متعددة، بما في ذلك البروتين المناعي2 وmicroRNA سحب أسفل12 ويسمح لجمع المصب من كل من البروتين ومكونات الحمض النووي الريبي. كما أنه يستخرج بكفاءة كل من البروتينات النووية والسيتولازمية (الشكل 2، الشكل 3، والشكل 4). وبالمثل، يسمح بروتوكول التوفير المناعي المقدم بعزل الحمض النووي الريبي عن البروتين المرتبط بالمناعة. في حين تم تطوير بروتوكول التنامي في الأصل لتحديد تفاعل البروتين ALG-1 ، يمكن تكييف الطريقة لاختبار التفاعلات بين أي بروتينات ذات أهمية. في الواقع، عملت ظروف التهيئة المناعية المستخدمة بشكل جيد بنفس القدر ل ALG-1(الشكل 3)و HRPK-1(الشكل 4). هذا البروتوكول هو نقطة انطلاق ممتازة لتثبيط المناعة من البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه قد تكون هناك حاجة إلى بعض التغييرات في تكوين العازلة لبروتينات أخرى ذات أهمية. وقد تعتمد التغيرات على الخصائص الفيزيائية والكيميائية الحيوية للبروتين الذي يهم ويجب تنفيذها على أساس كل حالة على حدة.
بمجرد أن يتم إعادة سرعة البروتين المستهدف (هنا، ALG-1 أو HRPK-1) مناعة، يمكن استخدام النشاف الغربي لاختبار البروبروسيبات المناعية المشتركة لمتفاعلات بروتين محددة.
وبدلا من ذلك، يمكن أن تخضع البروسيبيتات المناعية المكروبة لتحليل الطيف الكتلي لتحديد جميع البروتينات المتفاعلة المفترضة. ويمكن بعد ذلك فحص التفاعلات المؤكدة بين التخصصات المناعية المشتركة في مجموعة متنوعة من الخلفيات أو الظروف الوراثية لتحديد التنظيم المحتمل للتفاعل المحدد. على سبيل المثال، لتحديد ما إذا كان HRPK-1 يلعب دورا في تجميع ALG-1/AIN-1 miRISC، تم تقييم ALG-1-AIN-1 coprecipitation في خلفية من النوع البري وفي غياب HRPK-1 (الشكل 3). تم العثور على hrpk-1 أن يكون الاستغناء عن ALG-1/AIN-1 التفاعل2 (الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تكنولوجيا تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 لتوليد طفرات حذف نقطة واحدة أو المجال في البروتينات ذات الاهتمام. إعادة اختبار قدرة المسوخ المولدة على الانسداد مع تفاعل البروتين يمكن أن تكشف عن المجالات أو المخلفات التي تتوسط التفاعل المادي. يمكن أن تسفر هذه الدراسات المستقبلية عن معلومات لا تقدر بثمن حول آلية وظيفة البروتين وتنظيمه. ويمكن لهذه النهج، إلى جانب قوة علم الوراثة C. elegans، أن توفر رؤى هامة في العمليات الجزيئية الأساسية التي تحكم نمو الحيوان والوظيفة الخلوية.

يمكن أن يكون تحديد التفاعلات الجزيئية الكلية لبروتين مهم أمرا أساسيا لمعرفة المزيد عن وظيفته. يمكن استخدام تجارب التهيئة المناعية والمناعة المشتركة لتحديد التفاعل الكامل للبروتين من خلال النهج البروتيومية واسعة النطاق1 أو لاختبار قدرة البروتين على وجه التحديد على الانسداد مع تفاعل مفترض. في C. elegans، تم استخدام كلتا الطريقتين بنجاح لمعرفة المزيد عن نشاط مجموعة متنوعة من البروتينات ، بما في ذلك تلك التي تعمل بشكل وثيق مع microRNAs لتنظيم التعبير الجيني2و3و4. تتمتع تجارب نقص المناعة المشترك بميزة اختبار التفاعلات بين البروتين والبروتين في بيئتها الخلوية الأصلية ، ولكن إعداد الاستخراج يمكن أن يكون صعبا ويستغرق وقتا طويلا. من الضروري إجراء تحليل فعال للعينة ، ولكن يجب توخي الحذر لتقليل اضطراب التفاعلات بين البروتين والبروتين. أساليب مثل douncing5، سونيكيشن6، Balchالتجانس 7، وzirconia الخرز التجانس8،9 وقد استخدمت لإعداد بنجاح مقتطفات البروتين الكلي C. elegans. هذه الأساليب، باستثناء تجانس حبة الزركونيا، لها قيود من حيث عدد العينات التي يمكن معالجتها في وقت واحد. المقدمة هي طريقة بديلة التي يمكن توسيعها بسهولة للسماح لارتفاع الإنتاجية، وإعداد استخراج البروتين السريع من عينات C. elegans تليها التهيئة المناعية المشتركة. على وجه التحديد، يمكن أن تعد هذه الطريقة ما يصل إلى 24 عينة في وقت واحد، مما يقلل إلى حد كبير من الوقت اللازم لاستخراج التحضير. وعلى النقيض من ذلك، على سبيل المثال، يسمح douncing عادة بإعداد عينة واحدة فقط في كل مرة. يمكن استخدام طريقة استخراج هذه لإعداد مقتطفات من أي مرحلة تنموية من C. elegans.
وصف هو إجراء خطوة بخطوة لجمع عينات الحيوانات، وإعداد استخراج، والمناعة، وعرض البيانات النشاف الغربية لتأكيد سحب البروتين الناجح والكشف عن البروتين المشترك من المناعية ذات الاهتمام. ولإثبات فعالية البروتوكول، أجريت تجربتان مشتركتان في مجال المناعة بين 1) ميكرورنا أرغونات ALG-1 و AIN-1، وهو متجانس GW182؛ و20000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 و 2) ALG-1 و HRPK-1، وهو التفاعل ALG-1 التي تم تحديدها حديثا2. ALG-1 و AIN-1 هي البروتينات الأساسية التي تشكل مجمع إسكات الناجمة عن الحمض النووي الريبي الدقيق (miRISC) والتفاعل بين هذين البروتينينراسخة 10,11. كان بروتوكول إعداد المستخلصات فعالا في تجربة التهيئة المشتركة للمناعة ALG-1-AIN-1. كما أكد هذا البروتوكول بنجاح التفاعل بين ALG-1 والمتفاعل الذي تم تحديده حديثا، HRPK-12.
باختصار، تصف المخطوطة بروتوكول إعداد استخراج C. elegans الذي يمكن توسيع نطاقه لمعالجة 24 عينة في وقت واحد إلى جانب بروتوكول التأهب المناعي المشترك الذي يمكن استخدامه لتحديد التفاعلات الجديدة أو المؤكدة المفترضة بين البروتينات. بروتوكول إعداد استخراج متوافق مع عدد من التجارب المصب، بما في ذلك البروتين المناعي2 وmicroRNA الانسحابات12. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف بروتوكول التهيئة المناعية لاختبار التفاعلات بين أي اثنين أو أكثر من البروتينات الذاتية المنشأ، الموسومة داخليا، أو المفروشة أكثر من قيمتها C. elegans في مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:989px;" width="989">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">15 mL tube</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-664</td>
			<td style="width:213px;">STEP 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>1610737</td>
			<td>STEP 3.11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>4561096</td>
			<td>STEP 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-AIN-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-ALG-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm Homogenizer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9779-5G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10002D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">GFP antibody (FL)</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-8334</td>
			<td>Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">BioRed</td>
			<td style="width:119px;">1662408</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31470</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4034-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-95000</td>
			<td>STEP 4.3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:463px;">Magnesium chloride hexahydrate ACS</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">VWRV0288-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20170-333</td>
			<td>STEP 1.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 wild type</td>
			<td>CGC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>NAVYR1-RNA</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P285-3</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RC DC Protein Assay Kit I</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>5000121</td>
			<td>STEP 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10777019</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">TritionX-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100-500ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UY38 hrpk-1(zen17)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VT3841 alg-1(tm492)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

وكثيرا ما تستخدم أساليب الإفراط في المناعة لدراسة التفاعلات بين البروتين والبروتين. تأكيد التفاعلات البروتين البروتين المفترض أو تحديد جديدة يمكن أن توفر معلومات لا تقدر بثمن حول وظيفة البروتين من الفائدة. تتطلب بعض الطرق التقليدية لاستخراج التحضير في كثير من الأحيان تقنيات كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. هنا، يوصف بروتوكول إعداد استخراج معدلة باستخدام متجانس مطحنة حبة والخرز المعدني كبديل سريع لأساليب إعداد البروتين التقليدية. تتوافق طريقة إعداد المستخلص هذه مع دراسات التأهب المشترك في المصب. على سبيل المثال، تم استخدام هذه الطريقة بنجاح في المشاركة في المناعة C. elegans ميكرورنا أرغونات ALG-1 واثنين من المتفاعلين المعروفين ALG-1: AIN-1، و HRPK-1. يتضمن هذا البروتوكول وصفا لجمع عينات الحيوانات، وإعداد الاستخراج، وتوضيح الاستخراج، و وبروتين مناعة. يمكن تكييف البروتوكول الموصوف لاختبار التفاعلات بين أي اثنين أو أكثر من البروتينات الذاتية المنشأ أو الموسومة داخليا أو المفروشة بشكل مفرط C. elegans في مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية.

تم استخدام هذا البروتوكول (مخطط في الشكل 1)بنجاح للحصول على مقتطفات البروتين الكلي C. elegans (الشكل 2) لprecipitation المصب من عدةبروتينات 2 (الشكل 3 والشكل 4). وكان بروتوكول التجانس مطحنة حبة عرضت قابلة للمقارنة في استخراج البروتين الكلي لأساليب أساسها dounce (الشكل 2) واستخراجها بكفاءة النووية (COL-19::GFP(NLS) (الشكل 2) والبروتينات السيتوبلازمية (الشكل 3 والشكل 4). تم استخراج عينات متعددة من مختلف الأحجام في وقت واحد(الشكل 2). بروتينات الأرغونات تتفاعل مع أعضاء عائلة البروتين GW182، وتشكيل miRISCs التي تربط إلى RNAs رسول الهدف وقمع تعبيرهم10. ويبين الشكل 3 نجاح التوفير المناعي المشترك لمكونات الميكريسك الأساسية ALG-1 و AIN-1، بما يتفق مع التقارير السابقة11و17. وفي الآونة الأخيرة، بذلت جهود لتحديد تفاعلات بروتينية إضافية من أرغوناتALG-1 3 من أجل معرفة المزيد عن كيفية تنظيم التكوين الحيوي والنشاط من قبل العوامل المساعدة. تم تحديد البروتين الرابط للجيش الملكي النيبالي HRPK-1 في ال 1 ALG-1 مناعة3. وقد تأكد هذا التفاعل مؤخرا في تجربة تبادل HRPK-1المناعية 2. نجحت بروتوكولات استخراج والمناعة المعروضة في استعادة ALG-1 في البروتيبات المناعية المشتركة HRPK-1(الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، تم اختبار التفاعل ALG-1-AIN-1 في مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية وHRPK-1 تبين أن تكون غير ضرورية ل ALG-1/AIN-1 miRISCالتجمع 2 (الشكل 3). وتقدم أرقام تكميلية لإظهار الغشاء الكامل بحث (الشكل التكميلي 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> الشكل 1: تخطيط سير العمل ل C. elegans استخراج إعداد والمناعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> الشكل 2: مقارنة لطخة غربية ل GFP المترجمة النووية، COL-19::GFP(NLS)، ومستويات في عينات منسدلة ومتجانسة من 250 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من الكريات دودة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> الشكل 3: GW182 homolog AIN-1 الكوليسترول المناعي المشترك مع ALG-1. النشاف الغربي لبروتينات ALG-1 و AIN-1 في الكوليسترول المناعي ALG-1. ولم تتأثر نسبة المناعة المشتركة ALG-1/AIN-1 بغياب الهربك-1. الإدخال = 10٪ من الملكية الفكرية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> الشكل 4: الكوليسترول المناعي المشترك من ALG-1 مع HRPK-1. يظهر النشاف الغربي ل HRPK-1 و ALG-1 في الكوليسترول المناعي HRPK-1. الإدخال = 10٪ من الملكية الفكرية. * يشير إلى سلسلة الأجسام المضادة الثقيلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">المخزن المؤقت M9 (1 لتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 جم</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na 2HPO4
</td>
			<td>6 جم</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناكل</td>
			<td>5 جم</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 م مغسو4
</td>
			<td>1 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>حتى 1 لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x تحلل العازلة (5 مل)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (رقم الحموضة 7.4)</td>
			<td>200 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 م كلكل</td>
			<td>250 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>10٪ تريتونإكس</td>
			<td>100 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 م م م2
</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>100٪ الجلسرين</td>
			<td>1 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>حتى 5 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>إضافة جديدة:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 متر دي.ت.ت</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>مثبط بروتياز خالية من EDTA</td>
			<td>1 قرص</td>
		</tr>
<tr>
<td>كوكتيل مثبط فوسفاتاز 2</td>
			<td>100 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>كوكتيل مثبط فوسفاتاز 3</td>
			<td>100 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x تحلل المخزن المؤقت</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">تمييع 2x تحلل العازلة مع حجم متساو من ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x غسل العازلة 10 مل)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (رقم الحموضة 7.4)</td>
			<td>300 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 م كلكل</td>
			<td>500 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>10٪ تريتونإكس</td>
			<td>100 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 م م م2
</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>100٪ الجلسرين</td>
			<td>1 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>حتى 10 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 متر دي.ت.ت</td>
			<td>20 ميكرولتر (أضف طازجا)</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: وصفات
الشكل التكميلي 1- الزيادة في النسبة إلى 100 في المائة من ال تظهر الأغشية الغربية الكاملة المستخدمة لتوليد الأرقام 2-4. (أ) فحص غشاء الشكل 2. لاحظ أنه تم قطع الغشاء للسماح بالتحقيق المتزامن ل GFP و Tubulin ، مما يقلل من حجم البقعة الإجمالي. (ب) فحص غشاء الشكل 3. (ج) فحص الغشاء لل الشكل 3. * يدل على الأجسام المضادة سلسلة ثقيلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

يصف هذا الأسلوب بروتوكولا لإعداد استخراج البروتين عالي الإنتاجية من عينات Elegans Caenorhabditis وما تلاها من نقص المناعة.

إعداد استخراج البروتين و إعادة التأهيل المناعي المشترك من الإيغانات Caenorhabditis

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.7K Views.  Kansas State University. يصف هذا الأسلوب بروتوكولا لإعداد استخراج البروتين عالي الإنتاجية من عينات Elegans Caenorhabditis وما تلاها من نقص المناعة.

Video: Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

إعداد والثقافة من الخلايا عضلي السلائف / Myoblasts الابتدائية من العضلات الهيكلية من الكبار والمسنين البشر

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

طريقة بسيطة لتحديد الحركات التي تنظم تعدد القدرات الجذعية للخلايا الجذعية من خلال فحص المانع عالي الإنتاجية

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

تقييم "الليزوزومية الغدق" في "الأمعاء ومن يعيش" ايليجانس كاينورهابديتيس

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

دراسة "عنصر مؤكسد الإجهاد الناجم عن العقديّات المجموعة ميتس" في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

قياس الإرشاد المنوي والحركية داخل الجهاز التناسلي المخنث

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...