Este trabajo fue apoyado en parte por Kansas INBRE, P20GM103418 a Li y Zinovyeva y R35GM124828 a Zinovyeva. Agradecemos a Min Han por compartir generosamente el anticuerpo anti-AIN-1. Algunas de las cepas utilizadas en el transcurso de este trabajo fueron proporcionadas por el Centro de Genética caenorhabditis (CGC), financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).

1. Colección de muestras de gusanos
<ol><li>Sembrar etapa mixta osincronizar 13 gusanos en placas sólidas NGM a la temperatura requerida y permitir que los gusanos crezcan hasta la etapa deseada. Para el crecimiento y mantenimiento básicos de C. elegans, véase Stiernagle et al. y Porta-de-la-Riva et al.14,13.</li>
	<li>Recoge gusanos en un tubo centrífuga cónico de 15 ml lavando las placas de gusano con amortiguador M9.</li>
	<li>Peletizar los gusanos centrifugando a 400 x g a temperatura ambiente (RT) durante 2 min y desechar el sobrenadante. NOTA: El tamaño del pellet de gusano para la preparación de extractos es de entre 100 μL y 500 μL. Un pellet de 300 μL de gusanos envasados se recomienda para experimentos de inmunoprecipitación aguas abajo y normalmente produce ~4.5 mg de proteína total, mientras que un pellet de 500 μL producirá ~7.5 mg de proteína total.</li>
	<li>Realice 3-5 lavados adicionales con buffer M9 (ver Tabla 1)o hasta que el sobrenadante ya no esté nublado.</li>
	<li>Realice un lavado final con ddH2O.</li>
	<li>Mueva el pellet de gusano suelto a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y gire hacia abajo a 400 x g a RT durante 2 minutos. Deseche el sobrenadante restante para obtener un pellet de gusano embalado y proceda a extraer la preparación. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los pellets de gusano pueden congelarse repentinamente en nitrógeno líquido inmediatamente y almacenarse a -80 °C o en nitrógeno líquido. Tenga en cuenta que los pellets de gusano sólo se pueden descongelar una vez y no se pueden volver a congelar.</li>
</ol>2. Extraer la preparación del pellet de gusano
NOTA: La preparación del extracto debe realizarse en hielo o a 4 °C.
<ol><li>Si está congelado, descongele el pellet de gusano en hielo. NOTA: Si no se obtuvo el tamaño deseado de pellets de gusano envasado de 300 μL durante la recolección de muestras, se pueden combinar varios pellets más pequeños hasta que haya suficiente material para su posterior extracción.</li>
	<li>Añadir un volumen igual de amortiguador de lisis helada de 2x frío (HEPES de 60 mM, pH = cloruro de magnesio de 7,4, 100 mM cloruro de potasio, 0,1% Tritón X, cloruro de magnesio de 4 mM, 10% de glicerol, TDT de 2 mM con inhibidor de la RNase, inhibidor de la proteasa e inhibidores de la fosfatasa; ver Tabla 1) y vórtice o pipeta arriba y abajo para mezclar. Gire los tubos hacia abajo para recoger la mezcla en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Mueva la mezcla a un tubo libre de RNase de 1,5 ml que contenga cuentas metálicas (ver Tabla de materiales)y coloque la muestra en el homogeneizador del molino de cuentas (ver Tabla de Materiales)a 4 °C. Asegúrese de que las tapas del tubo estén apretujadas y las muestras estén equilibradas dentro del homogeneizador.</li>
	<li>Homogeneizar la muestra a la velocidad más alta (ajuste 12) durante 4 min.</li>
	<li>Retire la muestra de las cuentas y colóquela en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Alternativamente, un imán provisto con el homogeneizador se puede utilizar para eliminar las cuentas de la muestra.</li>
	<li>Gire el extracto a 19.000 x g durante 20 minutos a 4 °C para aclarar el extracto de proteína.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco de 1,5 ml sobre hielo, evitando el arrastre del precipitado blanco y nublado que se forma encima de la muestra. El sobrenadante es ahora el extracto aclarado. NOTA: Ahorre 10 μL del extracto aclarado para determinar la concentración total de proteínas.</li>
	<li>Utilice el extracto inmediatamente para los siguientes experimentos o flash congelar el extracto en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los extractos pueden almacenarse a temperatura ultrarrádiga (-80 °C congelador o nitrógeno líquido durante ~6 meses). Extractos congelados pueden ser descongelados una vez y no pueden ser refrozen.</li>
	<li>Determinar la concentración total de proteínas del extracto utilizando un kit de ensayo de concentración de proteínas compatible con detergentes (ver Tabla de materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>3. Inmunoprecipitación
NOTA: Todos los pasos de inmunoprecipitación para la preparación de extractos deben realizarse en hielo o a 4 °C. Se recomienda utilizar 2 mg de proteína total para cada inmunoprecipitación. Sin embargo, se han realizado inmunoprecipitaciones exitosas con 0,8–1 mg de proteína total. Utilice siempre extractos de proteínas frescos o recién descongelados. Se describe el siguiente protocolo para realizar la inmunoprecipitación a partir de 2 mg de proteína total, o un único experimento de inmunoprecipitación. La cantidad de cuentas y anticuerpos puede aumentarse o disminuirse en consecuencia para múltiples muestras o si se utiliza una cantidad diferente de extracto de proteína.
<ol><li>Coloque o descongele el extracto de proteína en el hielo. La muestra se puede diluir a 10 mg/ml o 5 mg/ml con amortiguador de lisis 1x frío en hielo (ver Tabla 1).</li>
	<li>Resuspend las cuentas magnéticas por inversión y transferir 150 μL de la suspensión de cuentas del 50% en un tubo de 1,5 ml. Magnetice las cuentas sobre hielo contra un soporte magnético durante 1 minuto o hasta que la solución esté clara. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Retire el tubo del soporte magnético y lave las cuentas en 1 amortiguador de lisis 1x utilizando 2 volúmenes (es decir, 300 μL) de lodo de cuentas. Repita el lavado 2x para un total de tres lavados.</li>
	<li>Resuspend las cuentas en 150 μL de tampón de lisis helada.</li>
	<li>Transferir 75 μL de la loda de cuentas a 2 mg de extracto de proteína e incubar a 4 °C durante 1 h con agitación suave. Guarde la suspensión de cordón restante en hielo para su uso posterior. NOTA: Este paso se realiza para reducir la unión de proteínas no específicas a las cuentas durante el paso de inmunoprecipitación.</li>
	<li>Coloque el tubo con muestra en el soporte magnético sobre hielo durante 1 minuto o hasta que las cuentas estén completamente magnetizadas y la muestra esté clara. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml; no molesten a las cuentas. Este es el lisato de proteína precleared. Ahorre un 10% de la muestra para el análisis de manchas occidentales.</li>
	<li>Añadir 20 μg de anticuerpo purificado de afinidad al lisato preclearizado e incubar a 4 °C durante 1 h con agitación suave. NOTA: La cantidad de anticuerpos utilizados para la inmunoprecipitación es específica del anticuerpo y la proteína y debe determinarse empíricamente para garantizar una inmunoprecipitación eficaz de la proteína objetivo.</li>
	<li>Añada los 75 μL restantes de la suspensión de cuentas prelavadas (paso 3.5) a la mezcla de anticuerpos/liados e incubar durante 1 h a 4 °C con agitación suave.</li>
	<li>Coloque el tubo en el soporte magnético sobre hielo durante 1 minuto o hasta que las cuentas estén completamente magnetizadas y la muestra esté clara. Guarde el sobrenadante para el análisis de manchas occidentales (opcional).</li>
	<li>Lave las cuentas que contienen el inmunoprecipitado 3x en 450 μL de tampón de lavado (30 mM HEPES, pH = 7,4, cloruro de potasio de 100 mM, 0,1% Tritón X, cloruro de magnesio de 2 mM, 10% glicerol, 1 mM TDT; ver Tabla 1)sobre hielo. NOTA: Se pueden realizar lavados adicionales si se prefieren condiciones de lavado más estrictas.</li>
	<li>Resuspend el pellet de cuentas en 20 μL de 2x Tampón de carga de gel proteico SDS/BME (ver Tabla de Materiales)y desnatura hirviendo a 95 °C durante 5 minutos antes de cargar en un gel SDS-PAGE. Alternativamente, las muestras desnaturalizados se pueden almacenar a -20 °C durante varios meses. NOTA: Una porción del inmunoprecipitato del cordón se puede guardar para el aislamiento del ARN aguas abajo, si se desea.</li>
</ol>4. Detección de manchas occidentales de muestras ip
<ol><li>Cargue las muestras IP en el gel SDS-PAGE (consulte Tabla de materiales). Evite transferir las cuentas colocando los tubos IP en el soporte magnético durante 1 minuto antes de la aspiración de la muestra.</li>
	<li>Realizar la hinchazón occidental15,16 y la tinción de anticuerpos16 con las siguientes modificaciones: diluir el anticuerpo ALG-117 1:500 en 5% leche seca no grasa (NFDM); diluir el anticuerpo HRPK-12 1:1,000 en 5% NFDM; y diluir el anticuerpo AIN-118 1:10,000 en 5% NFDM. Se utilizaron anticuerpos secundarios (ver Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Detecte las bandas con quimioluminiscencia basada en HRP (consulte Tabla de materiales).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

C. elegans es un excelente modelo para estudiar cuestiones fundamentales en biología celular, molecular y de desarrollo19. Además de su poder como sistema de modelos genéticos, C. elegans es apto para enfoques bioquímicos, incluyendo, pero no limitado a, inmunoprecipitación de proteínas y co-inmunoprecipitación. Un obstáculo potencial a la hora de llevar a cabo experimentos de inmunoprecipitación es la falta de anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Si no hay anticuerpo disponible, se pueden generar anticuerpos policlonales o monoclonales personalizados. Sin embargo, las innovaciones recientes en la tecnología de edición del genoma han permitido a los investigadores introducir rápidamente mutaciones o etiquetar genes C. elegans endógenos 20,21, facilitando estudios que desentrañan las interacciones genéticas, funcionales y físicas entre los genes y las proteínas codificadas. En concreto, el etiquetado mediado por CRISPR/Cas9 de los genes C. elegans en el loci endógeno ha reducido la dependencia de los experimentos de inmunoprecipitación en la disponibilidad de anticuerpos, haciendo que los experimentos de inmunoprecipitación sean mucho más factibles. Los genes C. elegans se pueden etiquetar con una variedad de etiquetas que van desde etiquetas fluorescentes como GFP o mCherry hasta pequeñas etiquetas como FLAG y HA. Los anticuerpos que reconocen estas etiquetas están disponibles comercialmente, facilitando los estudios de interacciones proteína-proteína a través de enfoques de inmunoprecipitación.
El protocolo presentado, descrito en la Figura 1,se puede realizar para un pequeño número de muestras o escalar verticalmente, lo que permite hasta 24 preparaciones de muestras a la vez. Mientras que las caracterizaciones iniciales de las interacciones proteína-proteína a través de la inmunoprecipitación se realizan típicamente en fondos de tipo salvaje en condiciones normales de cultivo, los estudios de seguimiento con frecuencia requieren probar las interacciones proteína-proteína en una variedad de orígenes genéticos o en diferentes condiciones de crecimiento. La capacidad de preparar simultáneamente múltiples extractos ahorra tiempo y, lo que es más importante, asegura la consistencia de preparación de extractos entre las diferentes muestras. Siempre se requiere un control negativo, siendo el control ideal una mutación nula en la codificación genética de la proteína inmunoprecipitada de interés (Ver Figura 3 y Figura 4 como ejemplos).
Este protocolo de extracto permite la preparación rápida de extractos de proteínas de muestras de C. elegans y es comparable a la homogeneización basada en abalorios de circonio8. La homogeneización de cuentas en general se puede escalar hasta múltiples preparaciones simultáneas de muestras utilizando una variedad de homogeneizadores de molinos de cuentas o equipos similares. Sin embargo, algunos homogeneizadores de molinos de cuentas más económicos pueden reducir el número de muestras que se pueden procesar simultáneamente. Alternativamente, el protocolo de extracto presentado es compatible con la preparación de extractos a base de dounce, que representa una alternativa económica. Mientras que diferentes homogeneizadores de molino de cuentas no fueron probados, la mayoría es probable que sean compatibles con este protocolo de extracto de proteínas, siempre y cuando se logre la interrupción completa de las muestras de C. elegans.
Como se presenta, este protocolo de preparación de extractos es compatible con múltiples experimentos posteriores, incluyendo inmunoprecipitación de proteínas2 y microRNA pull-down12 y permite la recolección aguas abajo de componentes de proteínas y ARN. También extrae eficientemente proteínas nucleares y citoplasmáticas(Figura 2, Figura 3y Figura 4). Del mismo modo, el protocolo de inmunoprecipitación presentado permite el aislamiento del ARN de los inmunoprecipitatos asociados a proteínas. Mientras que el protocolo de inmunoprecipitación fue desarrollado originalmente para identificar interactores proteicos ALG-1, el método se puede adaptar para probar las interacciones entre cualquier proteína de interés. De hecho, las condiciones de inmunoprecipitación utilizadas funcionaron igualmente bien para la inmunoprecipitación de ALG-1 (Figura 3) y HRPK-1 (Figura 4). Este protocolo es un excelente punto de partida para la inmunoproficación de proteínas que unen ARN. Sin embargo, cabe señalar que algunos cambios en la composición del buffer pueden ser necesarios para otras proteínas de interés. Los cambios pueden depender de las propiedades físicas y bioquímicas de la proteína de interés y deben implementarse caso por caso.
Una vez que la proteína objetivo (aquí, ALG-1 o HRPK-1) está inmunoprecipitada, la hinchazón occidental se puede utilizar para probar el co-inmunoprecipitado para interactores proteicos específicos.
Alternativamente, el inmunoprecipitato copurificado puede someterse a análisis de espectrometría de masas para identificar todas las proteínas que interactúan con el putativo. Las interacciones confirmadas de inmunoprecipitación conjunta pueden examinarse en una variedad de antecedentes genéticos o condiciones para identificar la regulación potencial de la interacción específica. Por ejemplo, para determinar si hrpk-1 desempeña un papel en el ensamblado MIRISC ALG-1/AIN-1, se evaluó la coprecipitación ALG-1-AIN-1 tanto en un fondo de tipo salvaje como en ausencia de HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 se encontró que era prescindible para la interacción ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Además, la tecnología de edición del genoma CRISPR/Cas9 se puede emplear para generar mutaciones de eliminación de un solo punto o dominio en las proteínas de interés. Volver a probar la capacidad de los mutantes generados para coprecipitar con sus interactores proteicos puede revelar qué dominios o residuos median en la interacción física. Estos estudios futuros pueden producir información inestimable sobre el mecanismo de función y regulación de las proteínas. Estos enfoques, combinados con el poder de la genética C. elegans, pueden proporcionar información importante sobre los procesos moleculares fundamentales que rigen el desarrollo animal y la función celular.

Identificar las interacciones macromoleculares de una proteína de interés puede ser clave para aprender más sobre su función. Los experimentos de inmunoprecipitación y co-inmunoprecipitación se pueden utilizar para identificar todo el interactoma de una proteína a través de enfoques proteómicos a gran escala1 o para probar específicamente la capacidad de una proteína para coprecipitar con un interactor hipotético. En C. elegans,ambos métodos se han empleado con éxito para aprender más sobre la actividad de una variedad de proteínas, incluidas las que funcionan estrechamente con microRNAs para regular la expresión génica2,3,4. Los experimentos de inmunoprecipitación co-tienen la ventaja de probar las interacciones proteína-proteína en su entorno celular nativo, pero la preparación de extractos puede ser desafiante y llevar mucho tiempo. Es necesaria una lisis eficiente de la muestra, pero se debe tener cuidado de minimizar la interrupción de las interacciones proteína-proteína. Métodos como la dotación5,sonicación6,homogeneización de Balch7,y zirconia cuentas-homogeneización8,9 se han utilizado para preparar con éxito C. elegans extractos de proteína total. Estos métodos, con la excepción de la homogeneización de cuentas zirconia, tienen limitaciones en términos del número de muestras que se pueden procesar simultáneamente. Presentado es un método alternativo que se puede escalar fácilmente para permitir la preparación de extractos proteicos rápidos de alto rendimiento a partir de muestras de C. elegans seguida de co-inmunoprecipitación. Específicamente, el método puede preparar hasta 24 muestras a la vez, reduciendo en gran medida el tiempo necesario para la preparación de extractos. Por el contrario, por ejemplo, el douncing normalmente permite una sola preparación de muestra a la vez. Este método de extracto se puede utilizar para preparar extractos de cualquier etapa de desarrollo de C. elegans.
Descrito es un procedimiento paso a paso para la recolección de muestras de animales, preparación de extractos, inmunoprecipitación y presentación de datos de distensión occidental para confirmar el cierre exitoso de proteínas y la detección de la proteína co-inmunoprecipitante de interés. Para demostrar la eficacia del protocolo, se realizaron dos experimentos de inmunoprecipitación compartida entre 1) microRNA Argonaute ALG-1 y AIN-1, un homolog GW182; y 2) ALG-1 y HRPK-1, un interactor ALG-1 recientemente identificado2. ALG-1 y AIN-1 son proteínas básicas que comprenden el complejo de silenciamiento inducido por microRNA (miRISC) y la interacción entre estas dos proteínas está bien establecida10,11. El protocolo de preparación de extractos fue eficaz en el experimento de coinprecipitación ALG-1-AIN-1. Este protocolo también confirmó con éxito la interacción entre ALG-1 y su interactor recién identificado, HRPK-12.
En resumen, el manuscrito describe un protocolo de preparación de extractos de C. elegans que se puede escalar hasta procesar simultáneamente 24 muestras junto con un protocolo de inmunoprecipitación que se puede utilizar para identificar interacciones nuevas o confirmar hipotestesizadas entre proteínas. El protocolo de preparación de extractos es compatible con una serie de experimentos posteriores, incluyendo inmunoprecipitación de proteínas2 y pulldowns de microRNA12. Además, el protocolo de inmunoprecipitación se puede adaptar para detectar interacciones entre dos o más proteínas C. elegans endógenas, etiquetadas endógenamente o sobreexpresadas en una variedad de orígenes genéticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:989px;" width="989">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">15 mL tube</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-664</td>
			<td style="width:213px;">STEP 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>1610737</td>
			<td>STEP 3.11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>4561096</td>
			<td>STEP 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-AIN-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-ALG-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm Homogenizer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9779-5G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10002D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">GFP antibody (FL)</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-8334</td>
			<td>Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">BioRed</td>
			<td style="width:119px;">1662408</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31470</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4034-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-95000</td>
			<td>STEP 4.3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:463px;">Magnesium chloride hexahydrate ACS</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">VWRV0288-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20170-333</td>
			<td>STEP 1.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 wild type</td>
			<td>CGC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>NAVYR1-RNA</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P285-3</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RC DC Protein Assay Kit I</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>5000121</td>
			<td>STEP 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10777019</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">TritionX-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100-500ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UY38 hrpk-1(zen17)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VT3841 alg-1(tm492)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

Los métodos de inmunoprecipitación co-se utilizan con frecuencia para estudiar interacciones proteína-proteína. La confirmación de interacciones hipotizadas proteína-proteínas o la identificación de otras nuevas puede proporcionar información invaluable sobre la función de una proteína de interés. Algunos de los métodos tradicionales para la preparación de extractos con frecuencia requieren técnicas intensivas en mano de obra y que consumen mucho tiempo. Aquí, un protocolo de preparación de extractos modificados utilizando un homogeneizador de molino de cuentas y cuentas de metal se describe como una alternativa rápida a los métodos tradicionales de preparación de proteínas. Este método de preparación de extractos es compatible con estudios de co-inmunoprecipitación aguas abajo. Como ejemplo, el método se utilizó para co-inmunoprecipitar correctamente C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 y dos interactores conocidos alG-1: AIN-1 y HRPK-1. Este protocolo incluye descripciones de la recolección de muestras de animales, preparación de extractos, aclaración de extractos e inmunoprecipitación de proteínas. El protocolo descrito se puede adaptar para detectar interacciones entre dos o más proteínas C. elegans endógenas, etiquetadas endógenamente o sobreexpresadas en una variedad de orígenes genéticos.

Este protocolo (esquematizado en la Figura 1)se utilizó con éxito para obtener extractos de proteína total C. elegans (Figura 2) para la inmunoprecipitación descendente de varias proteínas2 (Figura 3 y Figura 4). El protocolo de homogeneizador de molino de cuentas presentado era comparable en la extracción total de proteínas a métodos basados en dounce(Figura 2)y se extraía eficientemente nuclear (COL-19::GFP(NLS) (Figura 2) y proteínas citoplasmáticas (Figura 3 y Figura 4). Se extrajeron varias muestras de varios tamaños simultáneamente(Figura 2). Las proteínas Argonaute interactúan con los miembros de la familia de proteínas GW182, formando los miRISCs que se unen al mensajero objetivo RNAs y reprimen su expresión10. La Figura 3 muestra la co-inmunoprecipitación exitosa de los componentes miRISC centrales ALG-1 y AIN-1, de acuerdo con los informes anteriores11,17. Más recientemente, se hicieron esfuerzos para identificar interactores proteicos adicionales de Argonaute ALG-13 con el fin de aprender más acerca de cómo la biogénesis y la actividad del microRNA podrían estar reguladas por factores auxiliares. La proteína de unión al ARN HRPK-1 se identificó en inmunoprecipitatos ALG-13. Esta interacción se confirmó recientemente en un experimento recíproco de inmunoprecipitación HRPK-12. Los protocolos de extracción e inmunoprecipitación presentados recuperaron con éxito ALG-1 en co-inmunoprecipitatos específicos de HRPK-1 (Figura 4). Además, la interacción ALG-1—AIN-1 se probó en una variedad de antecedentes genéticos y se demostró que el HRPK-1 no era necesario para el ensamblaje2 de ALG-1/AIN-1 miRISC (Figura 3). Se proporcionan figuras suplementarias para mostrar la membrana completa sondeada(Figura suplementaria 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Figura 1: Esquema de flujo de trabajo para preparación e inmunoprecipitación de extractos de C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Figura 2: Comparación de manchas occidentales de un GFP localizado nuclear, COL-19::GFP(NLS), niveles en muestras preparadas para dounce y homogeneizadas de pellets de gusano de 250 μL y 100 μL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Figura 3: GW182 homolog AIN-1 co-inmunoprecipita con ALG-1. Hinchazón occidental para proteínas ALG-1 y AIN-1 en inmunoprecipitatos ALG-1. La co-inmunoprecipitación ALG-1/AIN-1 no se vio afectada por la ausencia de hrpk-1. Entrada = 10% de IP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Figura 4: ALG-1 co-inmunoprecipita con HRPK-1. Se muestra hinchazón occidental para HRPK-1 y ALG-1 en inmunoprecipitatos HRPK-1. Entrada = 10% de IP. * indica la cadena pesada de anticuerpos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Búfer M9 (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>hasta 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x búfer de lisis (5 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glicerol</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>hasta 5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Añadir fresco:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M TDT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inhibidor de la proteasa libre de EDTA</td>
			<td>1 comprimido</td>
		</tr>
<tr>
<td>cóctel inhibidor de la fosfatasa 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cóctel inhibidor de la fosfatasa 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x búfer de lisis</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Diluir 2x búfer de lisis con un volumen igual de ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x búfer de lavado 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glicerol</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>hasta 10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M TDT</td>
			<td>20 μL (añadir fresco)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Recetas
Figura suplementaria 1. Se muestran las membranas de mancha occidental sondeadas completas utilizadas para generar figuras 2-4. (A) Membrana sondeada para la Figura 2. Tenga en cuenta que la membrana se cortó para permitir el sondeo simultáneo de GFP y Tubulin, reduciendo el tamaño total de la mancha. (B) Membrana sondeada para la Figura 3. (C) Membrana sondeada para la Figura 3. *denota una cadena pesada de anticuerpos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Este método describe un protocolo para la preparación de extractos de proteína de alto rendimiento de caenorhabditis muestras de elegans y co-inmunoprecipitación posterior.

Preparación de extractos de proteínas y co-inmunoprecipitación de Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.7K vistas.  Kansas State University. Este método describe un protocolo para la preparación de extractos de proteína de alto rendimiento de caenorhabditis muestras de elegans y co-inmunoprecipitación posterior.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Preparación y cultivo de células precursoras miogénica / mioblastos primarios de músculo esquelético de los seres humanos adultos y envejecidos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

Un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Evaluación de alcalinización Lysosomal en el intestino de vivir Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Estudiar el estrés oxidativo causado por los estreptococos del grupo Mitis en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopía de lámina de luz isotrópica y análisis de linaje celular automatizado para catalogar Caenorhabditis elegans embriogénesis con resolución subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Medición de la orientación y la motilidad del esperma dentro del tracto reproductivo de la Caenorhabditis elegans hermafrodita

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...