이 작품은 부분적으로 캔자스 INBRE에 의해 지원되었다, P20GM103418 리와 지노비에바와 R35GM124828 지노비에바에. 한민한이 항아인-1 항체를 아낌없이 공유해 주셔서 감사합니다. 이 작업의 과정에서 사용되는 균주 중 일부는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무실에 의해 투자 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에 의해 제공되었다 (P40 OD010440).

1. 웜 샘플 수집
<ol><li>시드 혼합 단계 또는 동기화된 13 NGM 고형 플레이트에 필요한 온도에서 웜과 원하는 단계까지 웜이 성장할 수 있습니다. 기초 C. elegans 성장 및 유지 보수를 위해, Stiernagle 외와 포르타 드 라 -Riva 외.14,13을참조하십시오.</li>
	<li>M9 버퍼로 웜 플레이트를 세척하여 15mL 원심분리기 튜브에서 웜을 수집합니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 400xg에서 원심분리하여 2분 동안 벌레를 펠렛하고 상퍼를 폐기합니다. 참고: 추출 준비를 위한 벌레 펠릿 크기는 100 μL과 500 μL 사이입니다. 포장된 벌레의 300 μL 펠릿은 다운스트림 면역 침전 실험에 권장되며 일반적으로 총 단백질의 ~4.5 mg을 산출하고 500 μL 펠릿은 총 단백질의 ~7.5 mg을 산출합니다.</li>
	<li>M9 버퍼(표 1참조)로 또는 상퍼가 더 이상 흐리지 않은 때까지 3-5 세차스를 추가로 수행합니다.</li>
	<li>DdH2O로 마지막 세척을 수행합니다.</li>
	<li>느슨한 벌레 펠릿을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 이동하고 2분 동안 RT에서 400 x g로 회전합니다. 남은 상체를 버리고 포장된 벌레 펠릿을 구하고 준비를 진행한다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 웜 펠릿은 액체 질소에서 즉시 동결되어 -80°C 또는 액체 질소에 저장될 수 있다. 웜 펠릿은 한 번만 해동할 수 있으며 재냉동할 수 없습니다.</li>
</ol>2. 벌레 펠릿의 추출물 준비
참고: 추출 준비는 얼음이나 4°C에서 수행해야 합니다.
<ol><li>얼어 붙으면 얼음 위에 벌레 펠릿을 해동하십시오. 참고: 300 μL의 원하는 포장 된 벌레 펠릿 크기가 샘플 수집 중에 얻어지지 않은 경우, 추가 추출을 위해 충분한 재료가 존재 할 때까지 여러 개의 작은 펠릿을 결합 할 수 있습니다.</li>
	<li>얼음 차가운 2배 용해 버퍼(60mM HEPES)의 동일한 볼륨을 추가합니다. pH = 7.4, 100 mM 염화칼륨, 0.1% 트리톤 X, 염화 마그네슘 4m, 글리세롤 10% 글리세롤, RNase 억제제, 프로테아제 억제제 및 인산염 억제제가 있는 2mM DTT; 표 1)및 소용돌이 또는 파이프를 위아래로 참조하십시오. 튜브의 바닥에 혼합물을 수집하기 위해 튜브를 아래로 회전.</li>
	<li>혼합물을 금속 구슬이 들어 있는 1.5mL RNase-프리 튜브로 이동하고(재료표참조) 샘플을 4°C에서 비드 밀 균질화제(재료표 참조)에 넣습니다. 튜브 캡을 조이고 샘플이 균질화 내부에 균형을 이루도록 하십시오.</li>
	<li>샘플을 최고 속도(설정 12)에서 4분 동안 균질화합니다.</li>
	<li>구슬에서 샘플을 제거하고 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브에 배치합니다. 대안적으로, 균질화제와 함께 제공된 자석은 샘플에서 구슬을 제거하는 데 사용될 수 있다.</li>
	<li>4°C에서 20분 동안 19,000 x g에서 추출물을 스핀다운하여 단백질 추출물을 명확히 합니다.</li>
	<li>상체를 얼음 위에 있는 신선한 1.5mL 튜브로 옮기면서 샘플 위에 형성되는 흰색의 흐린 침전물의 이월을 피하십시오. 상체는 이제 명확한 추출물입니다. 참고: 정제된 추출물의 10μL을 저장하여 총 단백질 농도를 결정합니다.</li>
	<li>다음 실험에 즉시 추출물을 사용하거나 액체 질소에 추출물을 동결하고 -80°C에 저장한다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있습니다. 추출물은 초저온(-80°C 냉동고 또는 액체 질소~6개월)에 보관될 수 있다. 냉동 추출물은 한 번 해동될 수 있으며 재냉동할 수 없습니다.</li>
	<li>제조 업체의 지시에 따라 세제와 호환 되는 단백질 농도 분석 키트를 사용 하 여 추출 물의 총 단백질 농도를 결정 합니다(재료의 표참조) 제조 업체의 지침에 따라.</li>
</ol>3. 면역 침전
참고: 추출 준비를 위한 모든 면역 침전 단계는 얼음 또는 4°C에서 수행해야 합니다. 각 면역 강수량에 대해 총 단백질 2 mg을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 총 단백질의 0.8-1 mg을 가진 성공적인 면역 침전이 수행되었습니다. 항상 신선하거나 갓 해동된 단백질 추출물을 사용하십시오. 다음 프로토콜은 총 단백질 2 mg 또는 단일 면역 침전 실험으로부터 면역 침전을 수행하도록 설명된다. 구슬과 항체의 양은 여러 시료에 대해 또는 다른 양의 단백질 추출물이 사용되는 경우에 그에 따라 증가또는 감소될 수 있다.
<ol><li>얼음 위에 단백질 추출물을 놓거나 해동합니다. 샘플은 10 mg/mL 또는 얼음 차가운 1x 용해 완충액으로 5 mg/mL로 희석될 수 있습니다(표 1참조).</li>
	<li>자기 구슬을 반전하여 재중지하고 50% 구슬 서스펜션의 150 μL을 1.5mL 튜브로 옮기십시오. 얼음 위에 구슬을 자석으로 1분 동안 자석 스탠드에 매화하거나 용액이 명확해질 때까지 자화합니다. 상부체를 폐기합니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 비드 슬러리의 2부부(즉, 300 μL)를 사용하여 1배 의 용액 버퍼로 구슬을 세척합니다. 워시 2x를 총 3개의 세척으로 반복합니다.</li>
	<li>얼음 차가운 용해 버퍼의 150 μL에서 구슬을 다시 중단합니다.</li>
	<li>비드 슬러리의 75 μL을 단백질 추출물 2mg으로 옮기고 4°C에서 부드러운 동요로 1h로 배양합니다. 나중에 사용할 수 있는 나머지 비드 서스펜션을 얼음위에 저장합니다. 참고: 이 단계는 면역 침전 단계 동안 구슬에 대한 비특이적 단백질 결합을 감소시키기 위해 수행됩니다.</li>
	<li>1 분 동안 얼음에 자기 스탠드에 샘플튜브를 배치하거나 구슬이 완전히 자화되고 샘플이 명확 할 때까지 튜브를 놓습니다. 새로운 1.5 mL 튜브로 상체를 전송; 구슬을 방해하지 마십시오. 이것은 미리 정리된 단백질 리자입니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 샘플의 10%를 저장합니다.</li>
	<li>20 μg의 친화성 정제 항체를 미리 클리어된 lysate에 넣고 4°C에서 부드러운 교반으로 1h에 인큐베이션합니다. 참고: 면역 침전을 위해 사용되는 항체의 양은 항체 및 단백질에 특이하며 표적 단백질의 효과적인 면역 침전을 보장하기 위해 경험적으로 결정되어야 합니다.</li>
	<li>미리 세척된 비드 서스펜션(Step 3.5)의 나머지 75μL을 항체/용액 혼합물에 넣고 부드러운 교반으로 4°C에서 1시간 동안 배양한다.</li>
	<li>튜브를 1분 동안 얼음 위에 놓거나 구슬이 완전히 자화되고 샘플이 명확해질 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 웨스턴 블롯 분석(선택 사항)에 대한 상체를 저장합니다.</li>
	<li>세척 버퍼의 450 μL에서 면역 침전염 3 배를 포함하는 구슬을 세척 (30 mM HEPES, pH = 7.4, 100 mM 칼륨 염화, 0.1 % 트리톤 X, 2 mM MM 마그네슘 염화, 10 % 글리세롤, 1 mM M DTT; 표 1)얼음에 참조) 참고: 보다 엄격한 세척 조건이 바람직한 경우 추가 세척이 수행될 수 있습니다.</li>
	<li>비드 펠릿을 20 μL의 20 μL에서 재연하여 SDS-PAGE 젤에 적재하기 전에 5분 동안 95°C에서 끓여서 변성(재료 표참조) 및 변성. 대안적으로, 변성 된 샘플은 몇 달 동안 -20 °C에서 저장 될 수있다. 참고: 비드 면역 침전염의 일부가 원하는 경우 다운스트림 RNA 절연을 위해 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>4. IP 샘플의 서양 얼룩 감지
<ol><li>IP 샘플을 SDS-PAGE 젤에 로드합니다(재료 표참조). 시료의 포부 전에 1분 동안 자기 스탠드에 IP 튜브를 배치하여 구슬을 옮기지 마십시오.</li>
	<li>다음과 같은 수정으로 서양 블로팅15,16 및 항체 염색16을 수행하십시오: ALG-1항체를 희석17 1:500 에 5% 비지방 건조 우유 (NFDM); HRPK-1 항체2 1:1,000을 5% NFDM에서 희석; AIN-1항체를 희석18 1:10,000 에서 5% NFDM. 이차 항체(재료표참조)는 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.</li>
	<li>HRP 기반 화학 발광으로 대역을 감지합니다(재료 표참조).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. 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(64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. 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J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

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C. elegans는 세포, 분자 및 발달 생물학19에서근본적인 질문을 공부하기위한 훌륭한 모델입니다. 유전 적 모델 시스템으로서의 힘 외에도 C. elegans는 단백질 면역 침전 및 공동 면역 침전을 포함하되 이에 국한되지 않는 생화학적 접근법에 적합합니다. 면역 강수량 실험을 실시할 때 한 가지 잠재적인 장애물은 관심 있는 단백질에 특이적인 항체의 부족입니다. 항체가 없는 경우, 맞춤형 폴리클로날 또는 단일 클론 항체가 생성될 수 있다. 그러나, 게놈 편집 기술의 최근 혁신은 연구원이 유전자와 인코딩된 단백질 사이에서 유전, 기능 적, 물리적 상호 작용을 해명하는 연구 결과를 용이하게 하는 돌연변이 또는 꼬리표 내생 C. elegans 유전자20,21을급속하게 소개하는 것을 허용했습니다. 구체적으로, 내인성 loci에서 C. elegans 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 태깅은 항체 가용성에 대한 면역 침전 실험의 의존도를 감소시켜 공동 면역 침전 실험을 훨씬 더 실현가능하게 만듭니다. C. elegans 유전자는 GFP 또는 mCherry와 같은 형광 태그에서 플래그 및 HA와 같은 작은 태그에 이르기까지 다양한 태그로 태그될 수 있습니다. 이러한 태그를 인식하는 항체는 면역 침전 접근법을 통해 단백질 단백질 상호 작용의 연구를 용이하게, 시판적으로 쉽게 사용할 수 있습니다.
그림 1에설명된 제시된 프로토콜은 소수의 샘플에 대해 수행되거나 확장하여 한 번에 최대 24개의 샘플 준비를 허용합니다. 면역 침전을 통한 단백질 단백질 상호 작용의 초기 특성은 일반적으로 정상적인 성장 조건하에서 야생 유형 배경에서 수행되지만, 후속 연구는 다양한 유전 적 배경이나 다른 성장 조건 하에서 단백질 단백질 상호 작용을 테스트해야합니다. 여러 추출물을 동시에 준비하는 기능은 시간을 절약하고, 중요한 것은 다른 샘플 들 사이에서 추출 준비 일관성을 보장합니다. 음성 조절은 항상 필요하며, 이상적인 제어는 관심있는 면역 침전 단백질에 대한 유전자 인코딩의 null 돌연변이입니다 (예례로 도 3 및 도 4 참조).
이 추출물 프로토콜은 C. elegans 샘플에서 신속한 단백질 추출물 을 제조할 수 있게 해주며 지르코늄 비드 계균화8과비교할 수 있다. 비드 균질화는 일반적으로 다양한 비드 밀 균질화 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 다중 동시 시료 제제까지 확장될 수 있다. 일부 더 경제적인 비드 밀 균질화는 동시에 처리 될 수있는 샘플의 수를 줄일 수 있습니다, 그러나. 대안적으로, 제시된 추출 프로토콜은 경제적인 대안을 나타내는 음주 계 추출물 준비와 호환된다. 다른 비드 밀 균질화는 테스트되지 않았지만, 대부분은 C. elegans 샘플의 완전한 중단이 달성되는 한,이 단백질 추출물 프로토콜과 호환 될 가능성이 높습니다.
제시된 바와 같이, 본 추출물 제제 프로토콜은 단백질 면역침전2 및 마이크로RNA풀다운(12)을 포함한 여러 다운스트림 실험과 호환되며 단백질과 RNA 성분 모두의 다운스트림 수집을 가능하게 한다. 또한 핵 및 세포질 단백질을 효율적으로 추출합니다(도2, 도 3및 도 4). 유사하게, 제시된 면역침전 프로토콜은 단백질 관련 면역 침전염으로부터 RNA 절연을 허용한다. 면역 침전 프로토콜은 원래 ALG-1 단백질 인터액터를 식별하기 위해 개발되었지만, 이 방법은 관심있는 단백질 간의 상호 작용을 테스트하기 위해 적응될 수 있습니다. 실제로, 사용된 면역침전 조건은 ALG-1(도3)및 HRPK-1(도4)을면역침전시키는 데 동등하게 잘 작용하였다. 이 프로토콜은 RNA 결합 단백질의 면역 정화를 위한 우수한 출발점입니다. 그러나 완충 조성에 있는 몇몇 변경은 관심있는 그밖 단백질을 위해 요구될 수 있다는 것을 주의해야 합니다. 변경은 관심있는 단백질의 물리적 및 생화학적 특성에 따라 달라질 수 있으며 사례별로 구현되어야합니다.
표적 단백질(여기, ALG-1 또는 HRPK-1)이 면역침전이되면, 서양 블로팅은 특정 단백질 인터액터에 대한 공동 면역 전현전을 테스트하는 데 사용될 수 있다.
대안적으로, 코퓨화된 면역침전이는 모든 퍼티링 상호작용 단백질을 식별하기 위해 질량 분석 분석을 실시할 수 있다. 확인된 공동 면역 침전 상호 작용은 특정 상호 작용의 잠재적인 조절을 확인하기 위하여 유전 배경 또는 조건의 다양한에서 검토될 수 있습니다. 예를 들어, hrpk-1이 ALG-1/AIN-1 miRISC 어셈블리에서 역할을 하는지 여부를 결정하기 위해, ALG-1-AIN-1 회두는 야생형 배경과 HRPK-1의 부재 에서 모두 평가하였다(도3). hrpk-1은 ALG-1/AIN-1상호작용2(도 3)에대해 분배할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술은 관심 있는 단백질에서 단일 점 또는 도메인 삭제 돌연변이를 생성하기 위하여 이용될 수 있다. 생성된 돌연변이체가 단백질 인터액터와 결합하는 능력을 재테스트하면 물리적 상호 작용을 중재하는 도메인 또는 잔류물이 드러낼 수 있습니다. 이러한 미래 연구는 단백질 기능 및 조절의 메커니즘에 대 한 귀중 한 정보를 얻을 수 있습니다. C. elegans 유전학의 힘과 결합된 이 접근은, 동물 발달 및 세포 기능을 통제하는 기본적인 분자 프로세스에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

관심 있는 단백질의 거시분자 상호 작용을 식별하는 것이 그 기능에 대해 더 많이 배우는 데 핵심이 될 수 있습니다. 면역 침전 및 공동 면역 침전 실험은 대규모 프로테오믹 접근법1을 통해 단백질의 전체 상호 작용을 식별하거나 가설 상호 작용자와 결합하는 단백질의 능력을 구체적으로 테스트하는 데 사용될 수 있습니다. C. elegans에서,두 가지 방법은 유전자 발현2,3,4를조절하기 위해 microRNA와 밀접하게 기능하는 단백질의 다양한 활성에 대해 자세히 알아보기 위해 성공적으로 채택되었다. 공동 면역 침전 실험은 그들의 모국적인 세포 환경에서 단백질 단백질 상호 작용을 시험하는 이점이 있습니다, 그러나 추출 준비는 도전적이고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 시료의 효율적인 용해가 필요하지만 단백질-단백질 상호 작용의 중단을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 합니다. douncing5,초음파6,발치 균질화7,및 지르코니아 구슬 균질화8,9와 같은 방법은 성공적으로 C. elegans 총 단백질 추출물을 준비하는 데 사용되었습니다. 이러한 방법은 지르코니아 비드 균질화를 제외하고 동시에 처리될 수 있는 시료 수에 제한이 있습니다. 제시된 대안방법은 C. elegans 샘플로부터 높은 처리량, 신속한 단백질 추출물 제제를 허용하고 공동 면역 침전을 가능하게 하기 위해 쉽게 확장할 수 있는대안이다. 구체적으로, 이 방법은 한 번에 최대 24개의 샘플을 제조할 수 있으며, 추출 준비에 필요한 시간을 크게 줄일 수 있다. 대조적으로, 예를 들어, douncing은 일반적으로 한 번에 하나의 샘플 준비를 허용합니다. 이 추출 방법은 C. elegans의모든 발달 단계에서 추출물을 준비하는 데 사용할 수 있습니다.
설명된 것은 동물 샘플 수집, 추출물 제제, 면역 침전, 및 서양 블로팅 데이터의 프리젠테이션을 위한 단계별 절차로서 성공적인 단백질 풀다운 및 관심 있는 단백질의 검출을 확인한다. 프로토콜의 효과를 입증하기 위해, 2개의 공동 면역 침전 실험은 1) microRNA Argonaute ALG-1 및 AIN-1, GW182 상동성론 사이에서 수행되었다; 및 2) ALG-1 및 HRPK-1, 새로 확인된 ALG-1 상호작용기2. ALG-1 및 AIN-1은 마이크로RNA 유도 침묵 복합체(miRISC)를 포함하는 핵심 단백질이며 이들 두 단백질 간의 상호작용은10,11로잘 확립된다. 상기 추출물 제제 프로토콜은 ALG-1-AIN-1 공동 면역침전 실험에서 효과적이었다. 이 프로토콜은 또한 ALG-1과 새로 확인된 상호 작용자 HRPK-1 2 간의 상호 작용을 성공적으로확인했습니다.
요약하자면, 원고는 새로운 것을 식별하거나 단백질 간의 가설 상호 작용을 확인하는 데 사용할 수 있는 공동 면역 강수화 프로토콜과 함께 24개의 샘플을 동시에 처리할 수 있는 C. elegans 추출 준비 프로토콜을 설명합니다. 상기 추출물 제제 프로토콜은 단백질 면역침전2 및 마이크로RNA풀다운(12)을포함하는 다수의 다운스트림 실험과 호환된다. 더욱이, 면역 침전 프로토콜은 다양한 유전적 배경에서 어떤 둘 이상의 내인성, 내인성 태그, 또는 과발현C. elegans 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하기 위해 적응될 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:989px;" width="989">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">15 mL tube</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-664</td>
			<td style="width:213px;">STEP 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>1610737</td>
			<td>STEP 3.11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>4561096</td>
			<td>STEP 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-AIN-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-ALG-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm Homogenizer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9779-5G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10002D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">GFP antibody (FL)</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-8334</td>
			<td>Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">BioRed</td>
			<td style="width:119px;">1662408</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31470</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4034-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-95000</td>
			<td>STEP 4.3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:463px;">Magnesium chloride hexahydrate ACS</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">VWRV0288-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20170-333</td>
			<td>STEP 1.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 wild type</td>
			<td>CGC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>NAVYR1-RNA</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P285-3</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RC DC Protein Assay Kit I</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>5000121</td>
			<td>STEP 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10777019</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">TritionX-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100-500ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UY38 hrpk-1(zen17)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VT3841 alg-1(tm492)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

공동 면역 침전 방법은 단백질 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 자주 사용됩니다. 가설 단백질-단백질 상호 작용 또는 새로운 단백질의 식별확인은 관심 있는 단백질의 기능에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 추출 준비를 위한 전통적인 방법 중 일부는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 기술이 자주 필요합니다. 여기서, 비드 밀 균질화제 및 금속 비드를 이용한 변형된 추출물 제제 프로토콜은 전통적인 단백질 제제 방법에 대한 신속한 대안으로 설명된다. 이 추출 준비 방법은 다운스트림 공존침전 연구와 호환됩니다. 예를 들어, 이 방법은 C. 예르간 마이크로RNA 아르고나테 ALG-1 및 알려진 ALG-1 인터액터 인 AIN-1 및 HRPK-1을 성공적으로 공동 면역전성염하는 데 사용되었다. 이 프로토콜에는 동물 샘플 수집, 추출물 제제, 추출물 설명 및 단백질 면역 침전에 대한 설명이 포함됩니다. 설명된 프로토콜은 다양한 유전 적 배경에서 어떤 둘 이상의 내인성, 내인성 태그, 또는 과발현 C. elegans 단백질 사이의 상호 작용을 위해 테스트하도록 적응될 수 있다.

이러한 프로토콜(도 1에서 스키마화)은 여러 단백질2(도 3 및 도 4)의다운스트림 면역 침전을 위해 C. elegans 총 단백질 추출물(도2)을성공적으로 획득하는 데 사용되었다. 제시된 비드 밀 균질화 프로토콜은 총 단백질 추출에서비교하여-2)및 효율적으로 추출된 핵(COL-19:GFP(NLS)(도2)및 세포질단백질(도 3 및 도 4). 다양한 크기의 여러 샘플을 동시에 추출하였다(도2). 아르고나테 단백질은 GW182 단백질 제품군의 구성원과 상호 작용하여 표적 메신저 RNA에 결합하고발현(10)을억압하는 miRISC를 형성한다. 도 3은 코어 miRISC 성분 ALG-1 및 AIN-1의 성공적인 공동 면역 침전을 나타내며, 이전보고서(11,17)와일치한다. 최근에는 Argonaute ALG-13의 추가 단백질 인터랙터를 식별하여 미생물 생체 발생 및 활동이 보조 요인에 의해 어떻게 조절되는지에 대해 자세히 알아보려면 노력했습니다. RNA 결합 단백질 HRPK-1은 ALG-1 면역 침전염3에서확인되었다. 이러한 상호작용은 최근 상호 HRPK-1 면역침전 실험2에서확인되었다. 제시된 추출물 및 면역침전 프로토콜은 HRPK-1-1-co-specific 면역침전염(도4)에서ALG-1을 성공적으로 회수하였다. 또한, ALG-1-1 상호작용은 다양한 유전적 배경에서 시험되었고 HRPK-1은 ALG-1/AIN-1 miRISC 어셈블리2(도 3)에불필요하다고 나타났다. 보충 수치는 전체 멤브레인프로브(보충 도 1)를나타내기 위해 제공됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> 그림 1: C. elegans에 대한 워크플로식 회로도 추출 준비 및 면역 침전. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> 그림 2: 핵국산화된 GFP, COL-19:GFP(NLS)의 서양 얼룩 비교, 250 μL 및 100 μL 웜 펠릿에서 드온스 준비 및 균질화 된 샘플의 수준. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> 도 3: GW182 상동성AIN-1은 ALG-1과 공존한다. ALG-1 및 AIN-1 단백질을 위한 서양 블로팅은 ALG-1 면역 절전물염에 있습니다. ALG-1/AIN-1 공동 면역 침전은 hrpk-1의 부재에 의해 영향을 받지 않았다. 입력 = IP의 10%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> 도 4: HRPK-1을 결합한 ALG-1 공동 면역전수산. HRPK-1 면역절전염에서 HRPK-1 및 ALG-1을 위한 서부 블로팅이 도시된다. 입력 = IP의 10%. * 항체 무거운 사슬을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M9 버퍼 (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>나2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>나Cl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>최대 1L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x 리시스 버퍼 (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤페스 (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% 트리톤X</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>글리세롤 100%</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>최대 5mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>신선한 추가:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA 프리 프로테아제 억제제</td>
			<td>1 정수</td>
		</tr>
<tr>
<td>인스파타제 억제제 칵테일 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>포스파아제 억제제 칵테일 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x 리시스 버퍼</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">동일한 볼륨의 ddH20으로 2배 Lysis 버퍼를 희석합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x 워시 버퍼 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤페스 (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% 트리톤X</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>글리세롤 100%</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>최대 10mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL (신선한 추가)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 레시피
보충 도 1. 그림 2-4를 생성하는 데 사용되는 전체 프로브 웨스턴 블롯 멤브레인이 표시됩니다. (A) 도 2용 프로브 멤브레인. 멤브레인은 GFP와 Tubulin에 대한 동시 프로빙을 허용하기 위해 절단되어 전체 얼룩 크기를 줄였습니다. (B) 도 3에 대한 프로브 멤브레인. (C) 도 3에 대한 프로브 멤브레인. *항체 헤비 체인을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

이 방법은 Caenorhabditis elegans 샘플 및 후속 공동 면역 침전에서 고처리량 단백질 추출물 제조를 위한 프로토콜을 설명합니다.

카노르하비티스 예르간에서 단백질 추출물 제제 및 공동 면역 침전

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.7K 조회수.  Kansas State University. 이 방법은 Caenorhabditis elegans 샘플 및 후속 공동 면역 침전에서 고처리량 단백질 추출물 제조를 위한 프로토콜을 설명합니다.

비디오: Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

연구

발생학

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

성인 및 노인 인간의 골격 근육에서 근육 조직 전구체 세포 / 차 근육 아세포의 준비 및 문화

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

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Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

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Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

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The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

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The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

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Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

정자 지도 및 운동 성 아닌 간 남녀 양성 생식 기관에서 측정

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...