Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von Kansas INBRE, P20GM103418 an Li und Zinovyeva und R35GM124828 an Zinovyeva. Wir danken Min Han für die großzügige gemeinsame Nutzung des Anti-AIN-1-Antikörpers. Einige der im Laufe dieser Arbeit verwendeten Stämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) bereitgestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wurde.

1. Wurmprobensammlung
<ol><li>Samen gemischte Stufe oder synchronisiert13 Würmer auf NGM Feststoffplatten bei der erforderlichen Temperatur und lassen Sie die Würmer bis zum gewünschten Stadium wachsen. Grundlegende s. C. elegans Wachstum und Wartung finden Sie unter Stiernagle et al. und Porta-de-la-Riva et al.14,13.</li>
	<li>Sammeln Sie Würmer in einem 15 ml konischen Zentrifugenrohr, indem Sie die Schneckenplatten mit M9-Puffer waschen.</li>
	<li>Pellet die Würmer durch Zentrifugieren bei 400 x g bei Raumtemperatur (RT) für 2 min und entsorgen Sie den Überstand. HINWEIS: Die Schneckenpelletgröße für die Extraktzubereitung liegt zwischen 100 und 500 l. Für nachgelagerte Immunpräzipationsexperimente wird ein 300-L-Pellet verpackter Würmer empfohlen, der in der Regel 4,5 mg Gesamtprotein liefert, während ein 500-L-Pellet 7,5 mg Gesamtprotein ergibt.</li>
	<li>Führen Sie zusätzliche 3:5-Waschungen mit M9-Puffer (siehe Tabelle 1) oder bis der Überstand nicht mehr bewölkt ist.</li>
	<li>Führen Sie eine letzte Wäsche mit ddH2O durch.</li>
	<li>Das lose Schneckenpellet auf ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr verschieben und bei RT 2 min bei 400 x g drehen. Entsorgen Sie den verbleibenden Überstand, um ein gepacktes Wurmpellet zu erhalten, und fahren Sie mit der Extraktion der Zubereitung fort. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Wurmpellets können sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Bitte beachten Sie, dass Wurmpellets nur einmal aufgetaut werden können und nicht eingefroren werden können.</li>
</ol>2. Extraktvorbereitung des Schneckenpellets
HINWEIS: Die Extraktzubereitung sollte auf Eis oder bei 4 °C erfolgen.
<ol><li>Wenn gefroren, tauen Wurm Pellet auf Eis. HINWEIS: Wenn die gewünschte verpackte Schneckenpelletgröße von 300 l während der Probenentnahme nicht erreicht wurde, können mehrere kleinere Pellets kombiniert werden, bis genügend Material für die weitere Extraktion vorhanden ist.</li>
	<li>Fügen Sie ein gleiches Volumen eiskalter 2x Lysepuffer (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM Kaliumchlorid, 0,1% Triton X, 4 mM Magnesiumchlorid, 10% Glycerin, 2 mM DTT mit RNase-Hemmer, Protease-Inhibitor und Phosphatase-Inhibitoren hinzu; siehe Tabelle 1) und Wirbel oder Pipetten nach oben und unten, um sie zu mischen. Drehen Sie die Rohre nach unten, um das Gemisch an der Unterseite des Rohres zu sammeln.</li>
	<li>Die Mischung in ein 1,5 ml RNase-freies Rohr mit Metallperlen (siehe Materialtabelle)bewegen und die Probe in den Perlenmühlenhomogenisator (siehe Materialtabelle) bei 4 °C geben. Stellen Sie sicher, dass die Rohrkappen angezogen und die Proben innerhalb des Homogenisators ausbalanciert sind.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die Probe mit der höchsten Geschwindigkeit (Einstellung 12) für 4 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die Probe aus den Perlen und legen Sie sie in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Alternativ kann ein mit dem Homogenisator versehener Magnet verwendet werden, um die Perlen aus der Probe zu entfernen.</li>
	<li>Drehen Sie den Extrakt bei 19.000 x g für 20 min bei 4 °C, um den Proteinextrakt zu klären.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand in eine frische 1,5 ml Röhre auf Eis, während Sie die Übertragung des weißen, trüben Niederschlags vermeiden, der sich auf der Oberseite der Probe bildet. Der Überstand ist nun der geklärte Auszug. HINWEIS: Speichern Sie 10 l des geklärten Extraktes, um die Gesamtproteinkonzentration zu bestimmen.</li>
	<li>Verwenden Sie den Extrakt sofort für die folgenden Experimente oder blitzen Sie den Extrakt in flüssigem Stickstoff einfrieren und lagern Sie ihn bei -80 °C. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Extrakte können bei extrem niedriger Temperatur gelagert werden (-80 °C Gefrierschrank oder flüssiger Stickstoff für 6 Monate). Gefrorene Extrakte können einmal aufgetaut und nicht eingefroren werden.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration des Extrakts anhand eines mit Reinigungsmitteln kompatiblen Proteinkonzentrations-Assay-Kits (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
</ol>3. Immunitizipation
HINWEIS: Alle Immunpräzipitungsschritte zur Extraktpräparation sollten auf Eis oder bei 4 °C durchgeführt werden. Es wird empfohlen, 2 mg Gesamtprotein für jede Immunpräzipitation zu verwenden. Es wurden jedoch erfolgreiche Immunpräzipitationen mit 0,8–1 mg Gesamtprotein durchgeführt. Verwenden Sie immer frische oder frisch aufgetaute Proteinextrakte. Das folgende Protokoll wird beschrieben, um Immunpräzipitation von 2 mg Gesamtprotein oder ein einzelnes Immunpräzipitationsexperiment durchzuführen. Die Menge an Perlen und Antikörpern kann bei mehreren Proben oder bei Verwendung einer anderen Menge an Proteinextrakt entsprechend erhöht oder verringert werden.
<ol><li>Den Proteinextrakt auf Eis legen oder auftauen. Die Probe kann auf 10 mg/ml oder 5 mg/ml mit eiskaltem 1x Lysepuffer verdünnt werden (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Setzen Sie die magnetischen Perlen durch Inversion wieder auf und übertragen Sie 150 l der 50%igen Perlensuspension in ein 1,5 ml Rohr. Magnetisieren Sie die Perlen auf Eis gegen einen magnetischen Ständer für 1 min oder bis die Lösung klar ist. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Ständer und waschen Sie die Perlen in 1x Lysepuffer mit 2 Bänden (d. h. 300 l) Perlenschlämme. Wiederholen Sie die Wäsche 2x für insgesamt drei Wäschen.</li>
	<li>Setzen Sie die Perlen in 150 l eiskalten Lysepuffer aus.</li>
	<li>75 l der Perlenschlämme auf 2 mg Proteinextrakt übertragen und bei 4 °C für 1 h mit sanfter Rührung inkubieren. Speichern Sie die verbleibende Perlensuspension auf Eis für die spätere Verwendung. HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um die unspezifische Proteinbindung an Perlen während des Immunpräzipitationsschritts zu reduzieren.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr mit Probe auf den magnetischen Ständer auf Eis für 1 min oder bis die Perlen vollständig magnetisiert sind und die Probe klar ist. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr; die Perlen nicht stören. Dies ist das vorgereinigte Proteinlysat. Sparen Sie 10 % der Stichprobe für die Western Blot-Analyse.</li>
	<li>Fügen Sie dem vorgereinigten Lysat 20 g affinitätsgereinigten Antikörper hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C für 1 h mit sanfter Rührung. HINWEIS: Die Menge an Antikörpern, die für Die Immunpräzipitation verwendet werden, ist spezifisch für Antikörper und Protein eisern und sollte empirisch bestimmt werden, um eine wirksame Immunpräzipation des Zielproteins zu gewährleisten.</li>
	<li>Die restlichen 75 l der vorgewaschenen Perlensuspension (Schritt 3.5) in das Antikörper-Lysat-Gemisch geben und bei 4 °C mit sanfter Rührung 1 h bebrüten.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr in den magnetischen Ständer auf Eis für 1 min oder bis die Perlen vollständig magnetisiert sind und die Probe klar ist. Speichern Sie den Überstand für die Western Blot-Analyse (optional).</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen, die das Immunprecipitat 3x in 450 l Waschpuffer (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM Kaliumchlorid, 0,1% Triton X, 2 mM Magnesiumchlorid, 10% Glycerin, 1 mM DTT; siehe Tabelle 1) auf Eis enthalten. HINWEIS: Zusätzliche Waschungen können durchgeführt werden, wenn strengere Waschbedingungen bevorzugt werden.</li>
	<li>Setzen Sie das Perlenpellet in 20 l 2x SDS/BME-Proteingel-Ladepuffer (siehe Materialtabelle)wieder auf und denaturieren Sie das Perlenpellet 5 min vor dem Laden auf ein SDS-PAGE-Gel. Alternativ können denaturierte Proben mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden. HINWEIS: Ein Teil des Perlenimmunprecipitats kann auf Wunsch für die nachgeschaltete RNA-Isolierung gespeichert werden.</li>
</ol>4. Western Blot-Erkennung von IP-Proben
<ol><li>Laden Sie die IP-Proben auf das SDS-PAGE-Gel (siehe Materialtabelle). Vermeiden Sie die Übertragung der Perlen, indem Sie die IP-Röhren für 1 min vor der Aspiration der Probe auf den magnetischen Ständer legen.</li>
	<li>Führen Sie die Western Blotting15,16 und Antikörper Färbung16 mit den folgenden Modifikationen: verdünnen Sie den ALG-1 Antikörper17 1:500 in 5% fettfreie Trockenmilch (NFDM); den HRPK-1-Antikörper2 1:1.000 in 5% NFDM verdünnen; und verdünnen Sie den AIN-1-Antikörper18 1:10.000 in 5% NFDM. Sekundäre Antikörper (siehe Materialtabelle) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.</li>
	<li>Erkennen Sie die Bänder mit HRP-basierter Chemilumineszenz (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

C. elegans ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung grundlegender Fragen in der Zell-, Molekular- und Entwicklungsbiologie19. Zusätzlich zu seiner Macht als genetisches Modellsystem ist C. elegans für biochemische Ansätze geeignet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Protein-Immunpräzipitation und Co-Immunpräzipation. Eine mögliche Hürde bei der Durchführung von Immunpräzipitationsexperimenten ist der Mangel an Antikörpern, die für die Proteine von Interesse spezifisch sind. Wenn kein Antikörper verfügbar ist, können benutzerdefinierte polyklonale oder monoklonale Antikörper erzeugt werden. Jüngste Innovationen in der Genom-Editing-Technologie haben es Forschern jedoch ermöglicht, schnell Mutationen einzuführen oder endogene C. elegans Gene20,21zu markieren, was Studien erleichtert, die die genetischen, funktionellen und physikalischen Wechselwirkungen zwischen den Genen und den kodierten Proteinen entwirren. Insbesondere die CRISPR/Cas9-vermittelte Kennzeichnung von C. elegans-Genen an den endogenen Loci hat die Abhängigkeit von Immunpräzipitationsexperimenten von der Verfügbarkeit von Antikörpern reduziert und Co-Immunpräzipitationsexperimente viel realisierbarer gemacht. C. elegans Gene können mit einer Vielzahl von Tags getaggt werden, die von fluoreszierenden Tags wie GFP oder mCherry bis hin zu kleinen Tags wie FLAG und HA reichen. Antikörper, die diese Tags erkennen, sind leicht kommerziell verfügbar, was die Studien von Protein-Protein-Wechselwirkungen über Immunpräzipationsansätze erleichtert.
Das vorgelegte Protokoll, das in Abbildung 1beschrieben ist, kann für eine kleine Anzahl von Proben durchgeführt oder skaliert werden, so dass bis zu 24 Probenpräparate gleichzeitig möglich sind. Während die anfänglichen Charakterisierungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen über Immunpräzipitation enthoben in der Regel in wilden Hintergründen unter normalen Wachstumsbedingungen erfolgen, erfordern Folgestudien häufig Tests der Protein-Protein-Wechselwirkungen in einer Vielzahl von genetischen Hintergründen oder unter verschiedenen Wachstumsbedingungen. Die Möglichkeit, mehrere Extrakte gleichzeitig vorzubereiten, spart Zeit und sorgt vor allem für die Konsistenz der Extraktvorbereitung zwischen den verschiedenen Proben. Eine negative Kontrolle ist immer erforderlich, wobei die ideale Kontrolle eine Nullmutation in der Genkodierung für das immunvorzeichnetse Protein ist (Beispiele siehe Abbildung 3 und Abbildung 4).
Dieses Extraktprotokoll ermöglicht eine schnelle Proteinextrakt-Präparation aus C. elegans Proben und ist vergleichbar mit der zirkoniumperlenbasierten Homogenisierung8. Die Perlenhomogenisierung kann im Allgemeinen mit einer Vielzahl von Perlenmühlenhomogenisatoren oder ähnlichen Geräten auf mehrere gleichzeitige Probenpräparate skaliert werden. Einige wirtschaftlichere Perlenmühlenhomogenisatoren können jedoch die Anzahl der Proben reduzieren, die gleichzeitig verarbeitet werden können. Alternativ ist das vorgestellte Extraktprotokoll mit der dounce-basierten Extraktzubereitung kompatibel, was eine wirtschaftliche Alternative darstellt. Während verschiedene Perlenmühlenhomogenisatoren nicht getestet wurden, sind die meisten wahrscheinlich mit diesem Proteinextrakt-Protokoll kompatibel, solange eine vollständige Störung der C. elegans Proben erreicht wird.
Wie dargestellt, ist dieses Extraktvorbereitungsprotokoll mit mehreren nachgeschalteten Experimenten kompatibel, einschließlich Proteinimmunpräzipitation2 und microRNA Pull-down12 und ermöglicht die nachgelagerte Sammlung von Protein- und RNA-Komponenten. Es extrahiert auch effizient sowohl kerntechnische als auch zytoplasmatische Proteine (Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4). In ähnlicher Weise ermöglicht das vorgestellte Immunpräzipitationsprotokoll die RNA-Isolierung von proteinassoziierten Immunpräcipitaten. Während das Immunpräzipitationsprotokoll ursprünglich entwickelt wurde, um ALG-1-Proteininterakisatoren zu identifizieren, kann die Methode angepasst werden, um Wechselwirkungen zwischen beliebigen Proteinen zu testen. Tatsächlich funktionierten die verwendeten Immunpräzipitationsbedingungen bei der Immunpräzipierung von ALG-1 (Abbildung 3) und HRPK-1 (Abbildung 4) gleichermaßen gut. Dieses Protokoll ist ein ausgezeichneter Ausgangspunkt für die Immunreinigung von RNA-bindenden Proteinen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass einige Änderungen in der Pufferzusammensetzung für andere Proteine von Interesse erforderlich sein können. Die Veränderungen können von den physikalischen und biochemischen Eigenschaften des von Interesse sindden Proteins abhängen und müssen von Fall zu Fall umgesetzt werden.
Sobald das Zielprotein (hier ALG-1 oder HRPK-1) immunprezipiert ist, kann Western Blotting verwendet werden, um das Co-Immunoprecipitat auf bestimmte Proteininteraktoren zu testen.
Alternativ kann das korifizierte Immunprecipitat einer Massenspektrometrieanalyse unterzogen werden, um alle vermeintlich interagierenden Proteine zu identifizieren. Bestätigte Co-Immunpräzipitations-Wechselwirkungen können dann in einer Vielzahl von genetischen Hintergründen oder Bedingungen untersucht werden, um eine mögliche Regulierung der spezifischen Wechselwirkung zu identifizieren. Um beispielsweise festzustellen, ob hrpk-1 eine Rolle in der ALG-1/AIN-1 miRISC-Assembly spielt, wurde die ALG-1-AIN-1-Kopräzipation sowohl in einem wilden Typ-Hintergrund als auch in Abwesenheit von HRPK-1 (Abbildung 3) bewertet. hrpk-1 erwies sich als entbehrlich für DIE ALG-1/AIN-1-Wechselwirkung2 (Abbildung 3). Darüber hinaus kann die CRISPR/Cas9 Genom-Editing-Technologie eingesetzt werden, um Single-Point- oder Domain-Löschmutationen in den proteinen von Interesse zu erzeugen. Das erneute Testen der Fähigkeit der erzeugten Mutanten, mit ihren Proteininteraktoren zu koprezipieren, kann zeigen, welche Domänen oder Rückstände die physikalische Interaktion vermitteln. Solche zukünftigen Studien können unschätzbare Informationen über den Mechanismus der Proteinfunktion und -regulierung liefern. Diese Ansätze, kombiniert mit der Kraft der C. elegans Genetik, können wichtige Einblicke in die grundlegenden molekularen Prozesse liefern, die die Entwicklung und Zellfunktion von Tieren steuern.

Die Identifizierung der makromolekularen Wechselwirkungen eines Proteins von Interesse kann der Schlüssel sein, um mehr über seine Funktion zu lernen. Immunpräzipitations- und Co-Immunpräzipitationsexperimente können verwendet werden, um das gesamte Interom eines Proteins durch groß angelegte proteomische Ansätze1 zu identifizieren oder speziell die Fähigkeit eines Proteins zu testen, mit einem hypothetischen Interaktor zu koprezipieren. In C. eleganswurden beide Methoden erfolgreich eingesetzt, um mehr über die Aktivität einer Vielzahl von Proteinen zu erfahren, einschließlich derjenigen, die eng mit microRNAs zusammenarbeiten, um die Genexpression2,3,4zu regulieren. Co-Immunpräzipitationsexperimente haben den Vorteil, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in ihrer nativen zellulären Umgebung zu testen, aber die Extraktpräparation kann herausfordernd und zeitaufwändig sein. Eine effiziente Lyse der Probe ist notwendig, aber es muss darauf geachtet werden, die Störung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zu minimieren. Methoden wie Douncing5, Beschallung6, Balch Homogenisierung7und Zirkonia Perlen-Homogenisierung8,9 wurden verwendet, um C. elegans Gesamtproteinextrakte erfolgreich vorzubereiten. Diese Methoden, mit Ausnahme der Zirkonia-Perlenhomogenisierung, haben Einschränkungen in Bezug auf die Anzahl der Proben, die gleichzeitig verarbeitet werden können. Präsentiert ist eine alternative Methode, die leicht skaliert werden kann, um eine schnelle Proteinextrakt-Präparation mit hohem Durchsatz aus C. elegans-Proben mit anschließender Co-Immunpräzipation zuermöglichen. Insbesondere kann die Methode bis zu 24 Proben gleichzeitig vorbereiten, wodurch die Zeit für die Extraktvorbereitung erheblich reduziert wird. Im Gegensatz dazu erlaubt z. B. das Douncing in der Regel nur eine Probenvorbereitung nach der anderen. Diese Extraktmethode kann verwendet werden, um Extrakte aus jeder Entwicklungsphase von C. elegansvorzubereiten.
Beschrieben wird ein schrittweises Verfahren zur Entnahme von Tierproben, zur Extraktpräparation, Immunpräzipitation und zur Darstellung von Western Blotting-Daten, um einen erfolgreichen Proteinabzug und den Nachweis des mitimmunisierenden Proteins zu bestätigen. Um die Wirksamkeit des Protokolls zu demonstrieren, wurden zwei Co-Immunpräzipationsexperimente zwischen 1) microRNA Argonaute ALG-1 und AIN-1, einem GW182-Homolog, durchgeführt; und 2) ALG-1 und HRPK-1, ein neu identifizierter ALG-1-Interaktor2. ALG-1 und AIN-1 sind Kernproteine, die den microRNA-induzierten Silencing-Komplex (miRISC) bilden und die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Proteinen ist gut etabliert10,11. Das Extraktpräparationsprotokoll war im ALG-1-AIN-1-Koimmunpräzipitationsexperiment wirksam. Dieses Protokoll bestätigte auch erfolgreich die Interaktion zwischen ALG-1 und seinem neu identifizierten Interaktor HRPK-12.
Zusammenfassend beschreibt das Manuskript ein C. elegans Extrakt-Vorbereitungsprotokoll, das bis zur gleichzeitigen Verarbeitung von 24 Proben skaliert werden kann, zusammen mit einem Co-Immuno-Blutungsprotokoll, das verwendet werden kann, um neue oder hypothetische Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu identifizieren oder zu bestätigen. Das Extraktvorbereitungsprotokoll ist mit einer Reihe von nachgeschalteten Experimenten kompatibel, einschließlich Proteinimmunpräzipitation2 und microRNA Pulldowns12. Darüber hinaus kann das Immunpräzipitationsprotokoll angepasst werden, um Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehr endogenen, endogen markierten oder überexprimierten C. elegans-Proteinen in einer Vielzahl genetischer Hintergründe zu testen.

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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>1610737</td>
			<td>STEP 3.11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>4561096</td>
			<td>STEP 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-AIN-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-ALG-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm Homogenizer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9779-5G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10002D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">GFP antibody (FL)</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-8334</td>
			<td>Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">BioRed</td>
			<td style="width:119px;">1662408</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31470</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4034-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-95000</td>
			<td>STEP 4.3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:463px;">Magnesium chloride hexahydrate ACS</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">VWRV0288-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20170-333</td>
			<td>STEP 1.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 wild type</td>
			<td>CGC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>NAVYR1-RNA</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P285-3</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RC DC Protein Assay Kit I</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>5000121</td>
			<td>STEP 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10777019</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">TritionX-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100-500ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UY38 hrpk-1(zen17)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VT3841 alg-1(tm492)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

Co-Immunpräzipitationsmethoden werden häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Bestätigung von hypothetischen Protein-Protein-Wechselwirkungen oder die Identifizierung neuer Protein-Wechselwirkungen können unschätzbare Informationen über die Funktion eines von Interesse sindden Proteins liefern. Einige der traditionellen Methoden zur Extraktzubereitung erfordern häufig arbeitsintensive und zeitaufwändige Techniken. Hier wird ein modifiziertes Extraktvorbereitungsprotokoll mit einem Perlenmühlenhomogenisator und Metallperlen als schnelle Alternative zu herkömmlichen Proteinaufbereitungsmethoden beschrieben. Diese Extraktpräparationsmethode ist mit nachgeschalteten Co-Immunpräzipitationsstudien kompatibel. Als Beispiel wurde die Methode verwendet, um C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 und zwei bekannte ALG-1 Interaktoren erfolgreich zu koimmunisieren: AIN-1 und HRPK-1. Dieses Protokoll enthält Beschreibungen der Probenentnahme, der Extraktzubereitung, der Extraktklärung und der Proteinimmunpräzipitation. Das beschriebene Protokoll kann angepasst werden, um Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehr endogenen, endogen markierten oder überexprimierten C. elegans Proteinen in einer Vielzahl genetischer Hintergründe zu testen.

Dieses Protokoll (schematisiert in Abbildung 1) wurde erfolgreich verwendet, um C. elegans Gesamtproteinextrakte zu erhalten (Abbildung 2) für die nachgeschaltete Immunitizipation mehrerer Proteine2 (Abbildung 3 und Abbildung 4). Das vorgestellte K.o.-Protokoll zur Homogenisatoren-Gesamtmenge war mit douncebasierten Methoden (Abbildung 2) und effizient extrahierten Kernkernen (COL-19::GFP(NLS) (Abbildung 2) und zytoplasmatischen Proteinen ( Abbildung3 und Abbildung 4) vergleichbar. Mehrere Proben unterschiedlicher Größe wurden gleichzeitig extrahiert (Abbildung 2). Argonaute-Proteine interagieren mit Mitgliedern der GW182-Proteinfamilie und bilden die miRISCs, die an den Zielboten RNAs binden und ihre Expression unterdrücken10. Abbildung 3 zeigt die erfolgreiche Koimmunpräzipation der kernigen miRISC-Komponenten ALG-1 und AIN-1, im Einklang mit früheren Berichten11,17. In jüngerer Zeit wurden Anstrengungen unternommen, um zusätzliche Proteininteraktoren von Argonaute ALG-13 zu identifizieren, um mehr darüber zu erfahren, wie die MikroRNA-Biogenese und -aktivität durch Hilfsfaktoren reguliert werden könnte. Das RNA-bindende Protein HRPK-1 wurde in ALG-1-Immunpräcipitaten3identifiziert. Diese Wechselwirkung wurde kürzlich in einem reziprokierten HRPK-1-Immunpräzipitationsexperimentbestätigt 2. Die vorgestellten Extrakt- und Immunpräzipitationsprotokolle haben ALG-1 erfolgreich in HRPK-1-spezifischen Co-Immunpräcipitaten wiederhergestellt (Abbildung 4). Darüber hinaus wurde die ALG-1-AIN-1-Wechselwirkung in einer Vielzahl von genetischen Hintergründen getestet und HRPK-1 erwies sich für die ALG-1/AIN-1 miRISC-Baugruppe2 (Abbildung 3) als unnötig. Zusätzliche Zahlen werden zur Verfügung gestellt, um die vollständige Membransonde zu zeigen (Ergänzende Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Abbildung 1: Workflow-Schema für C. elegans Extrakt-Präparation und Immunpräzipitation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Abbildung 2: Western Blot Vergleich eines nuklear lokalisierten GFP, COL-19::GFP(NLS), Gehalte in dounce-prepared und homogenisierten Proben aus 250 l und 100 l Wurmpellets. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Abbildung 3: GW182 Homolog AIN-1 co-immunoprecipitates mit ALG-1. Western Blotting für ALG-1- und AIN-1-Proteine in ALG-1-Immunpräcipitaten. Die ALG-1/AIN-1 Co-Immunpräzipitation wurde durch das Fehlen von hrpk-1 nicht beeinflusst. Eingang = 10% der IP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Abbildung 4: ALG-1-Co-Immunpräcipitate mit HRPK-1. Western Blotting für HRPK-1 und ALG-1 in HRPK-1-Immunpräcipitaten wird gezeigt. Eingang = 10% der IP. * zeigt eine schwere Antikörperkette an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M9-Puffer (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>bis 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Lysispuffer (5 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% Glycerin</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>bis zu 5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frisch hinzufügen:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA-freier Protease-Inhibitor</td>
			<td>1 Tablette</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2</td>
			<td>100 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3</td>
			<td>100 l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Lysis-Puffer</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Lysispuffer mit gleichem Volumen von ddH20 verdünnen.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Waschpuffer 10 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% Glycerin</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>bis 10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 l (frisch hinzufügen)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Rezepte
Ergänzende Abbildung 1. Es werden vollständig sonsonierte westliche Blotmembranen gezeigt, die zur Erzeugung von Figuren 2-4 verwendet werden. (A) Sondenmembran für Abbildung 2. Beachten Sie, dass die Membran geschnitten wurde, um gleichzeitige Sondierungen für GFP und Tubulin zu ermöglichen, wodurch die Gesamtfleckgröße reduziert wurde. (B) Sondenmembran für Abbildung 3. (C) Sondenmembran für Abbildung 3. *bezeichnet die schwere Kette des Antikörpers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Diese Methode beschreibt ein Protokoll zur Herstellung von Proteinextrakten mit hohem Durchsatz aus Caenorhabditis elegans Proben und anschließender Co-Immunpräzipation.

Proteinextrakt-Präparation und Co-Immunpräzipitation von Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.6K Aufrufe.  Kansas State University. Diese Methode beschreibt ein Protokoll zur Herstellung von Proteinextrakten mit hohem Durchsatz aus Caenorhabditis elegans Proben und anschließender Co-Immunpräzipation.

Serie: Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Studium der oxidativen Stress verursachten Mitis Gruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Messung der Spermienführung und-beweglichkeit innerhalb der Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Isolierung spezifischer Neuronenpopulationen von Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...