Ce travail a été en partie soutenu par Kansas INBRE, P20GM103418 à Li et Zinovyeva et R35GM124828 à Zinovyeva. Nous remercions Min Han d’avoir généreusement partagé l’anticorps anti-AIN-1. Certaines des souches utilisées dans le cadre de ces travaux ont été fournies par le Centre de génétique caenorhabdite (CGC), financé par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440).

1. Collection d’échantillons de vers
<ol><li>Graines mélangées au stade ousynchronisées 13 vers sur les plaques solides NGM à la température requise et permettent aux vers de croître jusqu’au stade désiré. Pour la croissance et l’entretien de base de C. elegans, veuillez consulter Stiernagle et coll. et Porta-de-la-Riva et coll.14,13.</li>
	<li>Recueillir les vers dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL en lavant les plaques de ver avec tampon M9.</li>
	<li>Pelleter les vers en centrifugant à 400 x g à température ambiante (RT) pendant 2 min et jeter le supernatant. REMARQUE : La taille des granulés de ver pour la préparation de l’extrait se situe entre 100 μL et 500 μL. Une pastille de 300 μL de vers emballés est recommandée pour les expériences d’immunoprécipitation en aval et donne généralement ~4,5 mg de protéines totales, tandis qu’une pastille de 500 μL rapportera ~7,5 mg de protéines totales.</li>
	<li>Effectuez des lavages supplémentaires de 3 à 5 lavages avec tampon M9 (voir tableau 1)ou jusqu’à ce que le supernatant ne soit plus nuageux.</li>
	<li>Effectuez un dernier lavage avec ddH2O.</li>
	<li>Déplacez la pastille de ver lâche dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et faites tourner vers le bas à 400 x g à RT pendant 2 min. Jeter le surnatant restant pour obtenir une pastille de ver emballée et procéder à la préparation de l’extrait. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les granulés de ver peuvent être congelés immédiatement dans de l’azote liquide et stockés à -80 °C ou dans de l’azote liquide. Veuillez noter que les granulés de vers ne peuvent être décongelés qu’une seule fois et ne peuvent pas être recongelés.</li>
</ol>2. Extraire la préparation de la pastille de ver
REMARQUE : La préparation de l’extrait doit être effectuée sur glace ou à 4 °C.
<ol><li>S’il est congelé, décongeler les granulés de ver sur la glace. REMARQUE : Si la taille de granulés de ver emballée désirée de 300 μL n’a pas été obtenue au cours de la collecte de l’échantillon, plusieurs granulés plus petits peuvent être combinés jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de matériaux pour une extraction plus importante.</li>
	<li>Ajouter un volume égal de tampon de lyse 2x glacé (60 mM HEPES, pH = 7,4, chlorure de potassium de 100 mM, 0,1 % Triton X, chlorure de magnésium de 4 mM, 10 % glycérol, 2 mM TNT avec inhibiteur de la RNase, inhibiteur de la protéase et inhibiteurs de la phosphatase; voir le tableau 1) et vortex ou pipette de haut en bas pour mélanger. Faites tourner le tube (s) vers le bas pour recueillir le mélange au fond du tube.</li>
	<li>Déplacez le mélange dans un tube sans RNase de 1,5 mL contenant des perles métalliques (voir tableau des matériaux)et mettez l’échantillon dans l’homogénéiseur du moulin à perles (voir table des matériaux)à 4 °C. Assurez-vous que les bouchons de tube sont serrés et que les échantillons sont équilibrés à l’intérieur de l’homogénéiseur.</li>
	<li>Homogénéiser l’échantillon à la vitesse la plus élevée (réglage 12) pendant 4 min.</li>
	<li>Retirer l’échantillon des perles et le placer dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Alternativement, un aimant fourni avec l’homogénéiseur peut être utilisé pour enlever les perles de l’échantillon.</li>
	<li>Faire tourner l’extrait à 19 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour clarifier l’extrait de protéine.</li>
	<li>Transférer le surnatant dans un tube frais de 1,5 mL sur la glace, tout en évitant le report du précipité blanc et nuageux qui se forme sur le dessus de l’échantillon. Le surnatant est maintenant l’extrait clarifié. REMARQUE : Économisez 10 μL de l’extrait clarifié pour déterminer la concentration totale de protéines.</li>
	<li>Utilisez immédiatement l’extrait pour les expériences suivantes ou congèlez l’extrait dans de l’azote liquide et stockez-le à -80 °C. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les extraits peuvent être conservés à une température ultralow (-80 °C congélateur ou azote liquide pendant ~6 mois). Les extraits congelés peuvent être décongelés une fois et ne peuvent pas être recongelés.</li>
	<li>Déterminer la concentration totale en protéines de l’extrait à l’aide d’un kit d’analyse de concentration de protéines compatible avec les détergents (voir tableau desmatériaux) selon les instructions du fabricant.</li>
</ol>3. Immunoprécipice
REMARQUE : Toutes les étapes d’immunoprécipice pour la préparation d’extrait doivent être exécutées sur la glace ou à 4 °C. Il est recommandé d’utiliser 2 mg de protéines totales pour chaque immunoprécipitation. Cependant, des immunoprécipices réussies avec 0.8-1 mg de protéine totale ont été exécutées. Utilisez toujours des extraits de protéines frais ou fraîchement décongelés. Le protocole suivant est décrit pour effectuer l’immunoprécipitation de 2 mg de protéine totale, ou une expérience unique d’immunoprécipitation. La quantité de perles et d’anticorps peut être augmentée ou diminuée en conséquence pour plusieurs échantillons ou si une quantité différente d’extrait de protéine est utilisée.
<ol><li>Placer ou décongeler l’extrait de protéines sur la glace. L’échantillon peut être dilué à 10 mg/mL ou 5 mg/mL avec tampon de lyse 1x glacé (voir le tableau 1).</li>
	<li>Resuspendez les perles magnétiques par inversion et transférez 150 μL de la suspension de perles de 50% dans un tube de 1,5 mL. Magnétiser les perles sur la glace contre un support magnétique pendant 1 min ou jusqu’à ce que la solution soit claire. Jeter le surnatant.</li>
	<li>Retirer le tube du support magnétique et laver les perles dans un tampon de 1x lyse à l’aide de 2 volumes (c.-à-d. 300 μL) de boue de perles. Répétez le lavage 2x pour un total de trois lavages.</li>
	<li>Resuspendez les perles dans 150 μL de tampon de lyse glacée.</li>
	<li>Transférer 75 μL de boue de perle à 2 mg d’extrait de protéines et incuber à 4 °C pendant 1 h avec une agitation douce. Gardez le reste de la suspension de perle sur la glace pour une utilisation ultérieure. REMARQUE : Cette étape est effectuée pour réduire la liaison protéique non spécifique aux perles pendant l’étape d’immunoprécipice.</li>
	<li>Placez le tube avec l’échantillon sur le support magnétique sur la glace pendant 1 min ou jusqu’à ce que les perles soient entièrement magnétisées et que l’échantillon soit clair. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL; ne pas déranger les perles. C’est le lysate protéique prédéclegé. Économisez 10 % de l’échantillon pour l’analyse des taches occidentales.</li>
	<li>Ajouter 20 μg d’anticorps purifiés d’affinité au lysate précléarisé et incuber à 4 °C pendant 1 h avec une agitation douce. REMARQUE : La quantité d’anticorps utilisée pour l’immunoprécipitation est spécifique à l’anticorps et aux protéines et doit être déterminée empiriquement pour assurer une immunoprécipitation efficace de la protéine cible.</li>
	<li>Ajouter le reste de 75 μL de la suspension des perles prélavées (étape 3.5) au mélange anticorps/lysate et incuber pendant 1 h à 4 °C avec une agitation douce.</li>
	<li>Placez le tube dans le support magnétique sur la glace pendant 1 min ou jusqu’à ce que les perles soient entièrement magnétisées et que l’échantillon soit clair. Enregistrer le supernatant pour l’analyse des taches occidentales (facultatif).</li>
	<li>Laver les perles contenant l’immunoprécipice 3x dans 450 μL de tampon de lavage (30 mM HEPES, pH = 7,4, chlorure de potassium de 100 mM, 0,1% Triton X, chlorure de magnésium de 2 mM, 10% glycérol, 1 mM TNT; voir tableau 1) sur glace. REMARQUE : Des lavages supplémentaires peuvent être effectués si des conditions de lavage plus strictes sont préférables.</li>
	<li>Resuspendez la pastille de perles dans 20 μL de tampon de chargement de gel protéique SDS/BME (voir tableau des matériaux)et déliaturez en bouillant à 95 °C pendant 5 minutes avant de charger sur un gel SDS-PAGE. Alternativement, les échantillons dénaturés peuvent être stockés à -20 °C pendant plusieurs mois. REMARQUE : Une partie de l’immunoprécipice de perle peut être sauvée pour l’isolement en aval d’ARN, si désiré.</li>
</ol>4. Détection occidentale des taches d’échantillons de propriété intellectuelle
<ol><li>Chargez les échantillons IP sur le gel SDS-PAGE (voir tableau des matériaux). Évitez de transférer les perles en plaçant les tubes IP sur le support magnétique pendant 1 min avant l’aspiration de l’échantillon.</li>
	<li>Effectuez le ballonnementoccidental 15,16 et les taches d’anticorps16 avec les modifications suivantes : diluer l’anticorps ALG-117 1:500 dans 5 % de lait sec non gras (NFDM); diluer l’anticorps HRPK-12 1:1 000 dans 5 % NFDM; et diluer l’anticorpsAIN-1 18 1:10,000 dans 5% NFDM. Les anticorps secondaires (voir tableau desmatériaux) ont été utilisés selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Détecter les bandes avec la chimioluminescence à base de HRP (voir tableau des matériaux).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

C. elegans est un excellent modèle pour étudier les questions fondamentales en biologie cellulaire, moléculaire et développementale19. En plus de sa puissance en tant que système de modèle génétique, C. elegans est sensible aux approches biochimiques, y compris, mais sans s’y limiter, l’immunoprécipitation et la co-immunoprécipitation des protéines. Un obstacle potentiel lors de la conduite d’expériences d’immunoprécipice est le manque d’anticorps spécifiques aux protéines d’intérêt. Si aucun anticorps n’est disponible, des anticorps polyclonals ou monoclonaux personnalisés peuvent être générés. Cependant, les innovations récentes dans la technologie d’édition du génome ont permis aux chercheurs d’introduire rapidement des mutations ou tag endogènes gènes C. elegans 20,21, facilitant les études qui démêler les interactions génétiques, fonctionnelles et physiques entre les gènes et les protéines codées. Plus précisément, le marquage crispr/cas9-24 des gènes de C. elegans au loci endogène a réduit la dépendance des expériences d’immunoprécipitation sur la disponibilité d’anticorps, rendant des expériences de co-immunoprécipitation beaucoup plus réalisables. Les gènes C. elegans peuvent être marqués avec une variété d’étiquettes allant des étiquettes fluorescentes telles que GFP ou mCherry aux petites étiquettes telles que FLAG et HA. Les anticorps reconnaissant ces étiquettes sont facilement disponibles dans le commerce, facilitant les études des interactions protéine-protéine par des approches d’immunoprécipitation.
Le protocole présenté, décrit à la figure 1,peut être effectué pour un petit nombre d’échantillons ou mis à l’échelle, ce qui permet jusqu’à 24 préparations d’échantillons à la fois. Bien que les caractérisations initiales des interactions protéine-protéine par immunoprécipitation se font généralement dans des milieux de type sauvage dans des conditions de croissance normales, les études de suivi nécessitent fréquemment de tester les interactions protéine-protéine dans une variété de milieux génétiques ou dans des conditions de croissance différentes. La capacité de préparer simultanément plusieurs extraits permet de gagner du temps et, surtout, assure la cohérence de la préparation des extraits entre les différents échantillons. Un contrôle négatif est toujours nécessaire, le contrôle idéal étant une mutation nulle dans l’encodage génétique de la protéine d’intérêt immunoprécipitée (voir la figure 3 et la figure 4 par exemple).
Ce protocole d’extrait permet la préparation rapide d’extrait de protéine des échantillons de C. elegans et est comparable à l’homogénéisation à base de perle de zirconium8. L’homogénéisation des perles en général peut être réduite à plusieurs préparations simultanées d’échantillons à l’aide d’une variété d’homogénéisateurs de moulin à perles ou d’équipements similaires. Certains homogénéisants plus économiques moulin à perles peuvent réduire le nombre d’échantillons qui peuvent être traités simultanément, cependant. Alternativement, le protocole d’extrait présenté est compatible avec la préparation à base de dounce d’extrait, qui représente une alternative économique. Bien que différents homogénéisants de moulin à perles n’aient pas été testés, la plupart sont susceptibles d’être compatibles avec ce protocole d’extrait de protéine, tant que la perturbation complète des échantillons de C. elegans est atteinte.
Tel que présenté, ce protocole de préparation d’extrait est compatible avec de multiples expériences en aval, y compris l’immunoprécipitationdes protéines 2 et le retrait du microARN12 et permet la collecte en aval des composants protéiques et arn. Il extrait également efficacement les protéines nucléaires et cytoplasmiques (figure 2, figure 3et figure 4). De même, le protocole d’immunoprécipitation présenté permet l’isolement d’ARN des immunoprécipices protéine-associés. Bien que le protocole d’immunoprécipitation ait été initialement mis au point pour identifier les interacteurs protéiques ALG-1, la méthode peut être adaptée pour tester les interactions entre toutes les protéines d’intérêt. En fait, les conditions d’immunoprécipitation utilisées ont fonctionné également bien pour l’immunoprécipitation de l’ALG-1 (figure 3) et du HRPK-1 (figure 4). Ce protocole est un excellent point de départ pour l’immunopurification des protéines liant l’ARN. Il convient toutefois de noter que certains changements dans la composition tampon peuvent être nécessaires pour d’autres protéines d’intérêt. Les changements peuvent dépendre des propriétés physiques et biochimiques de la protéine d’intérêt et doivent être mis en œuvre au cas par cas.
Une fois que la protéine cible (ici, ALG-1 ou HRPK-1) est immunoprécipitatée, le ballonnement occidental peut être utilisé pour tester le co-immunoprécipice pour des interacteurs spécifiques de protéine.
Alternativement, l’immunoprécipice copurifié peut être soumis à l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier toutes les protéines d’interaction putatives. Les interactions confirmées de co-immunoprécipitation peuvent ensuite être examinées dans une variété de milieux ou de conditions génétiques afin d’identifier la régulation potentielle de l’interaction spécifique. Par exemple, pour déterminer si le hrpk-1 joue un rôle dans l’assemblage ALG-1/AIN-1 miRISC, la coprécipitation ALG-1-AIN-1 a été évaluée à la fois dans un contexte sauvage et en l’absence de HRPK-1 (figure 3). hrpk-1 s’est révélé dispensable pour l’interaction ALG-1/AIN-12 (Figure 3). En outre, la technologie d’édition du génome CRISPR/Cas9 peut être utilisée pour générer des mutations ponctuelles ou de suppression de domaine dans les protéines d’intérêt. Le retest de la capacité des mutants générés à coprécipifier avec leurs interacteurs protéiques peut révéler quels domaines ou résidus médiation l’interaction physique. De telles études futures peuvent fournir des informations précieuses sur le mécanisme de la fonction et de la régulation des protéines. Ces approches, combinées à la puissance de la génétique C. elegans, peuvent fournir des informations importantes sur les processus moléculaires fondamentaux qui régissent le développement des animaux et la fonction cellulaire.

L’identification des interactions macromoléculaires d’une protéine d’intérêt peut être essentielle pour en apprendre davantage sur sa fonction. Des expériences d’immunoprécipitation et de co-immunoprécipitation peuvent être utilisées pour identifier l’interaction entière d’une protéine par des approches protéomiquesà grande échelle 1 ou pour tester spécifiquement la capacité d’une protéine à coprécipifier avec un interacteur hypothéqué. Dans C. elegans, les deux méthodes ont été utilisées avec succès pour en apprendre davantage sur l’activité d’une variété de protéines, y compris celles qui fonctionnent étroitement avec les microARN pour réguler l’expressiondes gènes 2,3,4. Les expériences de co-immunoprécipitation ont l’avantage de tester les interactions protéine-protéine dans leur environnement cellulaire natal, mais la préparation des extraits peut être difficile et prendre beaucoup de temps. Une lyse efficace de l’échantillon est nécessaire, mais il faut prendre soin de minimiser la perturbation des interactions protéines-protéines. Des méthodes telles que le douncing5, la sonication6, l’homogénéisation de Balch7, et la zirconia perles-homogénéisation8,9 ontété employées pour préparer avec succès des extraits totaux de protéine de C. elegans. Ces méthodes, à l’exception de l’homogénéisation des perles de zirconia, ont des limites en termes de nombre d’échantillons qui peuvent être traités simultanément. Présentée est une méthode alternative qui peut être facilement mise à l’échelle pour permettre une préparation rapide et à haut débit d’extrait de protéine à partir d’échantillons de C. elegans suivis de co-immunoprécipice. Plus précisément, la méthode peut préparer jusqu’à 24 échantillons à la fois, réduisant considérablement le temps nécessaire à la préparation de l’extrait. En revanche, par exemple, le douncing ne permet généralement qu’une seule préparation d’échantillon à la fois. Cette méthode d’extrait peut être utilisée pour préparer des extraits de n’importe quel stade de développement de C. elegans.
Décrit est une procédure étape par étape pour la collecte d’échantillons d’animaux, la préparation d’extraits, l’immunoprécipitation et la présentation de données de ballonnement occidental pour confirmer le retrait réussi des protéines et la détection de la protéine co-immunoprécipitante d’intérêt. Pour démontrer l’efficacité du protocole, deux expériences de co-immunoprécipitation ont été exécutées entre 1) microARN Argonaute ALG-1 et AIN-1, un homolog GW182 ; et 2) ALG-1 et HRPK-1, un nouvel interacteur ALG-12. ALG-1 et AIN-1 sont des protéines de base qui composent le complexe de silencing induit par microARN (miRISC) et l’interaction entre ces deux protéines estbien établie 10,11. Le protocole de préparation d’extrait était efficace dans l’expérience de co-immunoprécipation d’ALG-1-AIN-1. Ce protocole a également confirmé avec succès l’interaction entre ALG-1 et son nouvel interacteur, HRPK-12.
En résumé, le manuscrit décrit un protocole de préparation d’extrait de C. elegans qui peut être mis à l’échelle jusqu’à traiter simultanément 24 échantillons avec un protocole de co-immunoprécipitation qui peut être utilisé pour identifier de nouvelles interactions ou confirmer des interactions supposées entre les protéines. Le protocole de préparation de l’extrait est compatible avec un certain nombre d’expériences en aval, y compris l’immunoprécipitationdes protéines 2 et les retraits de microARN12. En outre, le protocole d’immunoprécipitation peut être adapté pour tester les interactions entre deux protéines C. elegans endogènes ou plus endogènes dans une variété de milieux génétiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:989px;" width="989">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">15 mL tube</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-664</td>
			<td style="width:213px;">STEP 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>1610737</td>
			<td>STEP 3.11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>4561096</td>
			<td>STEP 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-AIN-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-ALG-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm Homogenizer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9779-5G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10002D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">GFP antibody (FL)</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-8334</td>
			<td>Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">BioRed</td>
			<td style="width:119px;">1662408</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31470</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4034-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-95000</td>
			<td>STEP 4.3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:463px;">Magnesium chloride hexahydrate ACS</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">VWRV0288-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20170-333</td>
			<td>STEP 1.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 wild type</td>
			<td>CGC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>NAVYR1-RNA</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P285-3</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RC DC Protein Assay Kit I</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>5000121</td>
			<td>STEP 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10777019</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">TritionX-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100-500ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UY38 hrpk-1(zen17)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VT3841 alg-1(tm492)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

Les méthodes de co-immunoprécipitation sont fréquemment utilisées pour étudier les interactions protéine-protéine. La confirmation d’interactions protéinées-protéines supposées ou l’identification de nouvelles interactions peuvent fournir des informations précieuses sur la fonction d’une protéine d’intérêt. Certaines des méthodes traditionnelles pour la préparation d’extrait exigent fréquemment des techniques laborieurs et chronophages. Ici, un protocole modifié de préparation d’extrait utilisant un homogénéisateur de moulin de perle et des perles en métal est décrit comme alternative rapide aux méthodes traditionnelles de préparation de protéine. Cette méthode de préparation d’extrait est compatible avec des études en aval de co-immunoprécipitation. À titre d’exemple, la méthode a été utilisée pour co-immunoprécipifier avec succès C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 et deux interacteurs connus d’ALG-1 : AIN-1, et HRPK-1. Ce protocole inclut des descriptions de la collecte d’échantillon d’animal, de la préparation d’extrait, de la clarification d’extrait, et de l’immunoprécipice de protéine. Le protocole décrit peut être adapté pour tester les interactions entre deux protéines C. elegans endogènes ou plus en endogènes ou surexprimées dans une variété de milieux génétiques.

Ce protocole (schématisé à la figure 1) a été utilisé avec succès pour obtenir des extraits totaux de protéines C. elegans (figure 2) pour l’immunoprécipitation enaval de plusieurs protéines 2 (figure 3 et figure 4). Le protocole homogénéisant présenté par le moulin à perles était comparable dans l’extraction totale des protéines aux méthodes à base de dounce (figure 2) et extrait efficacement nucléaire (COL-19::GFP (NLS) (Figure 2) et protéines cytoplasmiques (figure 3 et figure 4). Plusieurs échantillons de différentes tailles ont été extraits simultanément (Figure 2). Les protéines argonautes interagissent avec les membres de la famille des protéines GW182, formant les miRISCs qui se lient aux ARN messagers cibles et répriment leur expression10. La figure 3 montre une co-immunoprécipitation réussie des composants miRISC de base ALG-1 et AIN-1, conformément aux rapportsprécédents 11,17. Plus récemment, des efforts ont été déployés pour identifier d’autres facteurs protéiques d’ArgonauteALG-1 3 afin d’en apprendre davantage sur la façon dont la biogenèse et l’activité des microARN pourraient être réglementées par des facteurs auxiliaires. La protéine liant l’ARN HRPK-1 a été identifiée dans les immunoprécipicesALG-1 3. Cette interaction a été récemment confirmée dans une expérience réciproque d’immunoprécipitation HRPK-12. Les protocoles présentés d’extrait et d’immunoprécipitation ont réussi à récupérer ALG-1 dans les co-immunoprécipices spécifiques à HRPK-1 (figure 4). De plus, l’interaction ALG-1—AIN-1 a été testée dans divers milieux génétiques et il a été démontré que le HRPK-1 n’était pas nécessaire pour l’assemblage2 de l’ALG-1/AIN-1 miRISC (figure 3). Des chiffres supplémentaires sont fournis pour montrer la membrane complète sondée(Figure supplémentaire 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Figure 1 : Schéma de flux de travail pour la préparation et l’immunoprécipice d’extrait de C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Figure 2 : Comparaison des taches occidentales d’un GFP localisé nucléaire, COL-19::GFP (NLS), niveaux dans des échantillons préparés et homogénéisés de dounce de 250 μL et de 100 granulés de ver de μL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Figure 3 : GW182 homolog AIN-1 co-immunoprécipice avec ALG-1. Ballonnement occidental pour les protéines ALG-1 et AIN-1 dans les immunoprécipices ALG-1. La co-immunoprécipitation alg-1/AIN-1 n’a pas été affectée par l’absence de hrpk-1. Entrée = 10% de la propriété intellectuelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Figure 4 : Co-immunodéprécipices ALG-1 avec HRPK-1. Le ballonnement occidental pour HRPK-1 et ALG-1 dans les immunoprécipices HRPK-1 est montré. Entrée = 10% de la propriété intellectuelle. * indique chaîne lourde d’anticorps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Tampon M9 (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl (NaCl)</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>jusqu’à 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampon 2x Lysis (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glycérol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>jusqu’à 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ajouter frais:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M TNT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inhibiteur de la protéase sans EDTA</td>
			<td>1 comprimé</td>
		</tr>
<tr>
<td>cocktail inhibiteur de phosphatase 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cocktail inhibiteur de phosphatase 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampon de lyse</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Diluer le tampon 2x Lysis avec un volume égal de ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampon wash 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glycérol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>jusqu’à 10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M TNT</td>
			<td>20 μL (ajouter frais)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Recettes
Figure supplémentaire 1. Les membranes de tache occidentales sondées complètes utilisées pour générer les figures 2-4 sont montrées. (A) Membrane sondée pour la figure 2. Notez que la membrane a été coupée pour permettre une sonder simultanément pour GFP et Tubulin, réduisant ainsi la taille globale des taches. (B) Membrane sondée pour la figure 3. (C) Membrane sondée pour la figure 3. *désigne la chaîne lourde d’anticorps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Cette méthode décrit un protocole pour la préparation d’extrait de protéine à haut débit des échantillons d’elegans de Caenorhabditis et la co-immunoprécipitation suivante.

Préparation et co-immunoprécipitation d’extrait de protéine de Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.6K vues.  Kansas State University. Cette méthode décrit un protocole pour la préparation d’extrait de protéine à haut débit des échantillons d’elegans de Caenorhabditis et la co-immunoprécipitation suivante.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

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Biologie du développement

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Préparation et culture de cellules Myogenic Précurseurs / myoblastes primaires de muscle squelettique des adultes et les humains âgés

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

Une méthode simple pour identifier les kinases qui réglementent la pluripotence des cellules souches embryonnaires par un dépistage des inhibiteurs à haut débit

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilisation Caenorhabditis elegans , à analyser le Transport intracellulaire dans les neurones

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Évaluer l’alcalinisation Lysosomal dans l' intestin de vivre Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Analyse de calcul de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans pour étudier la Distribution des noyaux, les protéines et le cytosquelette

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Étudier le Stress oxydatif causé par les streptocoques de groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopie isotrope en feuilles légères et analyse automatisée de la lignée cellulaire au catalogue Caenorhabditis elegans embryogenèse avec résolution subcellulaire

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Mesure du sperme guidage et motilité dans le Caenorhabditis elegans hermaphrodite appareil de reproduction

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Isolement des populations neuronales spécifiques de Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...