الجلوتاثيون S-transferases, GSTs, هي الإنزيمات الأيضية التي تتحلل المركبات الكهربائية داخل الخلايا وتتفاعل مع مكابس MAP المشاركة في مسار موت الخلايا المبرمج. بسبب هذين الدورين من التعبير عن ضريبة السلع والخدمات يرتبط مع مقاومة المخدرات, حل لمواجهة هذه المسألة هو استخدام مثبطات انزيمية. مع هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة لاختبار مثل هذه الجزيئات.
وتهدف هذه الطريقة إلى كل شخص جديد في مجال مثبطات GST، الذين يرغبون في استخدام طريقة سريعة وسهلة لفحص التفاعل في مجمع انزيم. كما نقدم الخطوات لتحديد اثنين من خصائص المانع، والتركيز المثبط 50، IC50، وثابت تثبيط، Ki.As وصفنا جيدا تقنية لتحديد طريقة تثبيط، وهي سمة هامة لها عواقب بيولوجية مختلفة. الخطوة الأولى هي تحديد النشاط الأنزيمي GST في حل لكل وحدة.
وحدة واحدة لكل ميل هو حجم الانزيم اللازم لتجميع ميكرومولار واحد من المنتج في الدقيقة الواحدة. كمي تركيز البروتين من محلول الانزيم. اختيار تقنية وفقا لراحتك.
تخفيف محلول البروتين إلى تركيز نهائي من 0.02 ملليغرام لكل ميل في الماء. الحفاظ على الحل الأنزيمي على الجليد. إعداد رد الفعل في لوحة 96-جيدا.
إضافة 20 ميكرولترات من المياه للآبار الفارغة. إضافة 20 ميكرولترات من الحل الأنزيمي لاختبار الآبار. إضافة 20 ميكرولترات من GSH.
إضافة 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. إضافة 10 ميكرولترات من CDNB في 50 ملليمولار في كل بئر. اخلطي الطبق على شاكر لبضع ثوانٍ.
مع قارئ لوحة الطيفي، تسجيل امتصاص في 340 نانومتر كل دقيقة لمدة 10 دقائق. تحليل النتائج في جدول البيانات ومع برنامج متخصص. وفقا للنتائج التي تم الحصول عليها، وإعداد حل الأسهم GST في 0.1 وحدة لكل مليون في الماء.
إعداد ستة تركيزات مختلفة من CDNB 20 مرات في 95٪ الإيثانول في حجم النهائي من 200 ميكرولتر. في كل بئر، إضافة 20 ميكرولترات من GSH في 25 ملليمولار. إلى آبار الاختبار، أضف 20 ميكرولترات من ضريبة السلع والخدمات بمعدل 0.1 وحدة لكل ميل.
إلى الآبار الفارغة، أضف 20 ميكرولترات من الماء. في كل بئر ، إضافة 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. إلى آبار الاختبار والآبار الفارغة، إضافة 10 ميكرولترات من الحل CDNB المقابلة.
كل تركيز من CDNB يحتاج إلى فارغة محددة. اخلط المحتوى على شاكر لبضع ثوان، وسجل الامتصاص في 340 نانومتر كل دقيقة لمدة 10 دقائق. تحليل النتائج باستخدام برنامج متخصص.
تحديد كم بواسطة رسم مؤامرة Michaelis-Menten. وفقا للنتائج, إعداد حل CDNB في 20 مرات كم التي تم الحصول عليها في 95٪ الإيثانول. تخفيف الحل المانع إلى التركيز المطلوب.
في لوحة 96-well، إضافة اثنين من microliters من المانع GST المحتملة. إلى الآبار الفارغة، إضافة اثنين من microliters من الملوين. إضافة 20 ميكرولترات من GSH في 25 ملليمولار في كل بئر و 168 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.
إضافة 10 ميكرولترers من CDNB 20 مرة كم وجدت خلال الخطوة السابقة. اخلطي الطبق على شاكر لبضع ثوانٍ. تسجيل امتصاص في 340 نانومتر كل دقيقة لمدة 10 دقائق.
تحليل النتائج باستخدام برنامج متخصص. وفقا للنتائج، يمكن استخدام نفس الفراغ لكل مثبطات GST أو يجب تعديلها. إعداد تسعة تركيزات من مثبط GST اختبارها.
إعداد حل مقال تتكون من 148 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني و 20 ميكرولتر من GSH في 25 نانوموللار لتفاعل واحد. مزيج جيد من الحل. بالنسبة لآبار الاختبار، أضف اثنين من ميكرولترات من مثبطات GST، و20 ميكرولترات من GST، و0.1 وحدة لكل ميل، و168 ميكرولترات من محلول المقايسة.
لآبار التحكم، إضافة اثنين من microliters من diluent المستخدمة لمثبط GST، 20 ميكرولترات من GST 0.1 وحدة لكل ميل، و 168 ميكرولترات من محلول المقايسة. بالنسبة للآبار الفارغة ، أضف اثنين من microliters من المزيل المستخدم لمثبط GST ، و 20 ميكرولترات من الماء و 168 ميكرولترات من محلول الفحص. إضافة 10 ميكرولترات من الحل CDNB لكل بئر، بما في ذلك فارغة.
مزيج على شاكر لبضع ثوان. تسجيل امتصاص في 340 نانومتر كل دقيقة لمدة 10 دقائق. احسب IC50 مع برنامج متخصص.
إعداد أربعة حلول CDNB بتركيزات مختلفة كما هو موضح في البروتوكول. إعداد ثلاثة حلول مثبطات GST بتركيزات مختلفة، كما هو موضح أيضا في البروتوكول. إعداد حلول الأنزيمية التي تحتوي على 148 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني و 20 ميكرولتر من GSH في 25 ملليمولار لتفاعل واحد.
بالنسبة لآبار التحكم، أضف اثنين من ميكرولترات من المزيل المستخدم لمثبط GST. وللاختبار والآبار الفارغة، وهما ميكرولترات من الحل الصحيح مثبطات GST. مزيج لبضع ثوان.
إضافة 168 ميكرولترات من الحل الأنزيمية لكل بئر. إضافة 10 ميكرولترات من تركيزات CDNB المقابلة في كل بئر. مزيج لبضع ثوان، ثم سجل امتصاص في 340 نانومتر كل دقيقة لمدة 10 دقائق.
كرر التجربة باستخدام نفس نمط الطلاء من أجل استخدام أربعة تركيزات مختلفة من CDNB على طول ثلاثة تركيزات مختلفة من مثبطات GST. تحليل النتائج مع برنامج متخصص لتحديد طريقة تثبيط، وكذلك تم تطبيق بروتوكول Ki.This إلى الكركمين، جزيء مع خصائص مكافحة اخصائية. تم اختيار هذا المركب بواسطة تنبؤات حسابية لتقارب الربط للعديد من isoforms GST.
وبالتوازي مع ذلك، أجريت نفس التجارب على حمض الإثاماريك، وهو أكثر مثبطات GST استخداماً في بيئة المختبرات كتحكم إيجابي. تم اختبار قوة المثبطة على مجموعة من GSTs من الكبد الخيول ويمكن تطبيقها على أي isoforms GST من الاختيار. تم تحديد IC 50 وكذلك نوع من تثبيط وكي.
من أجل توفير أفضل الشروط المقايسة، أولا، تم تحديد ماليس-مينتين ثابت، كم من الركيزة CDNB مع مجموعة من GSTs. كم هو ممثل عن التقارب بين الركيزة والانزيم. تحديد هذه القيمة أمر بالغ الأهمية من أجل استخدام تركيز غير مشبع للمقال.
في الواقع، قد يكون تركيزان عاليان ضرّقان مثبطات تنافسية، في حين أن كمية قليلة جداً لن تكون قابلة للكشف. يرجى الاطلاع على النصوص لمزيد من التفاصيل حول هذا الموضوع. لهذه التجربة، تم استخدام ستة تركيزات مختلفة من CDNB مع تركيز ثابت من إنزيمات GSH و GST.
تم الحصول على الرسم البياني ميخائيليس مينتن عن طريق رسم تركيزات الركيزة في الملميلولار على المحور س والسرعة في مليمولار في الدقائق على المحور ص. تم حساب سرعة التفاعل مع المعادلة الأولى. يتم تحديد كم كما Vmax نصف، وهي قيمة تم الحصول عليها بعد تشبع الحل مع الركيزة من أجل الحصول على هضبة من تشكيل مترافق.
تم تحديد كم من CDNB لحل GST الأنزيمي اختبارها كما 0.26 ملليمولار على أساس الحسابات مع برنامج متخصص. ويعرف IC50 بأنه تركيز المادة اللازمة لمنع نشاط الانزيم بمقدار النصف. تم تقدير IC50 باستخدام رسم بياني انحداري غير خطي حيث تم رسم التركيز اللوغاريتمي لمثبط GST على المحور س والنسبة المئوية لنشاط GST على المحور Y.
واستخدمت تسعة تركيزات مختلفة من مثبطات. تم تحديد نشاط ضريبة السلع والخدمات مع تطبيق المعادلة الأولى. تم تطبيع النتائج باستخدام السيطرة مع عدم وجود مانع.
الكركمين هو غير قابل للذوبان في الماء. وبالتالي لم يكن من الممكن استخدام تركيزات أعلى، مما يجعل من الصعب الحصول على الحد الأقصى من التثبيط. ومع ذلك، كان برنامج متخصص قادرا على التنبؤ IC50 من المناهج لهذا المجمع من ضريبة السلع والخدمات بقيمة 31.4 micromolar.
وبالتوازي، أجريت نفس التجربة باستخدام حمض الإثاماريكك كتحكم إيجابي. كما هو متوقع، تم تأكيد هذا الجزيء كمثبط GST مع IC50 من 6.7 ميكرومولار. وأكدت هذه النتائج أن الكركمين هو كذلك مثبط GST مع IC50 في نطاق micromolar, على غرار حمض الإثاكريك.
لدراسة أكثر تفصيلا الكركمين كمثبط GST, تم تحديد نوع من تثبيط, فضلا عن ثابت تثبيط, كي. أولاً، تم تقييم نوع تثبيط مع الرسوم البيانية ميخائيليس مينتين. باستخدام تركيزات مختلفة من الركيزة CDNB في حين زيادة تركيزات المانع GST, Kms زيادة كبيرة في الارتباط مع تركيزات الكركمين بينما ظل Vmax دون تغيير على الرغم من الظروف المختلفة.
هذا النمط من تثبيط هو نموذجي من وضع تنافسي من تثبيط. وللمزيد من التفاصيل عن أنواع الموانع الأخرى، يرجى الرجوع إلى النص. تم حساب كي بناء على ذلك على أساس نوع تثبيط باستخدام نفس مجموعة البيانات، وتوفير قيمة 23.3 ميكرومولار من الكركمين.
الأساليب الموضحة هي مقالات انزيمية أساسية ، والتي تتطلب الحذر من خلال خطوات معينة من أجل تقديم نتائج صحيحة وقابلة للتكرار. تحديد من الميكاليس-مينتن ثابت كم, أن يحدد تقارب الركيزة إلى الإنزيم هي واحدة من الخطوات الحاسمة. في الواقع، عندما يكون تركيز الركيزة عالية جدا أو منخفضة جدا، فإنه يجعل من الصعب تحديد الوضع الصحيح من تثبيط وكي لا يحسب بشكل صحيح.
يمكن تطبيق هذا الإجراء على GSTs المؤتلف البشري، على سبيل المثال GSTA1 وأحد P1، وتستخدم في دراسات ثقافة الخلية لتقييم إمكانية استخدامها في تركيبة مع وكلاء كهربائي للحد من مقاومة المخدرات.
