Glutationa S-transferases, GSTs, são enzimas metabólicas que degradam compostos eletrofílicos intracelulares e interagem com as quinases MAP envolvidas na via da apoptose. Devido a esses dois papéis de expressão do GST estão correlacionados com a resistência às drogas, uma solução para neutralizar essa questão é usar inibidores enzimáticos. Com este protocolo, fornecemos uma maneira de testar tais moléculas.
Este método é voltado para todos os novos no campo dos inibidores gst, que desejam utilizar um método rápido e fácil para examinar a interação entre enzimas enzimáticos. Também fornecemos as etapas para determinar duas características de um inibidor, a concentração inibitória 50, IC50, e a constante de inibição, Ki.As bem descrevimos a técnica para definir o modo de inibição, característica importante que tem diferentes consequências biológicas. O primeiro passo é determinar a atividade enzimática do GST em solução por unidade.
Uma unidade por mil é o volume de enzima necessário para sintetizar um micromolar de produto por minuto. Quantifique a concentração proteica da solução enzimática. Escolha a técnica de acordo com sua conveniência.
Diluir a solução proteica para uma concentração final de 0,02 miligramas por mil em água. Mantenha a solução enzimática no gelo. Prepare a reação em uma placa de 96 poços.
Adicione 20 microliters de água para os poços em branco. Adicione 20 microliters da solução enzimática para os poços de teste. Adicione 20 microliters de GSH.
Adicione 150 microliters de PBS. Adicione 10 microliters de CDNB a 50 mililitros em cada poço. Misture a placa em um agitador por alguns segundos.
Com um leitor de placas espectrofotométricas, registose a absorvância em 340 nanômetros a cada minuto durante 10 minutos. Analisar os resultados em uma planilha e com um software especializado. De acordo com os resultados obtidos, prepare uma solução de estoque GST a 0,1 unidades por mil em água.
Prepare seis concentrações diferentes de CDNB 20 vezes em 95% de etanol em um volume final de 200 microliters. Em cada poço, adicione 20 microliters de GSH a 25 mililitros. Aos poços de teste, adicione 20 microliters do GST a 0,1 unidade por mil.
Aos poços em branco, adicione 20 microliters de água. Em cada poço, adicione 150 microliters de PBS. Aos poços de teste e aos poços em branco, adicione 10 microliters da solução CDNB correspondente.
Toda concentração de CDNB precisa de um espaço em branco específico. Misture o conteúdo em um agitador por alguns segundos, grave a absorvância em 340 nanômetros a cada minuto durante 10 minutos. Analise os resultados com um software especializado.
Determine o Km desenhando um plano Michaelis-Menten. De acordo com os resultados, prepare uma solução CDNB em 20 vezes o Km obtido em 95% de etanol. Diluir a solução inibidora à concentração necessária.
Em uma placa de 96 poços, adicione dois microliters do potencial inibidor GST. Aos poços em branco, adicione dois microliters do diluído. Adicione 20 microliters de GSH a 25 mililitros em cada poço e 168 microliters de PBS.
Adicione 10 microliters de CDNB 20 vezes Km encontrados durante a etapa anterior. Misture a placa em um agitador por alguns segundos. Regisso absorvente em 340 nanômetros a cada minuto durante 10 minutos.
Analise os resultados com um software especializado. De acordo com os resultados, o mesmo em branco pode ser usado para cada inibidor GST ou deve ser ajustado. Prepare nove concentrações do inibidor GST testado.
Prepare a solução de ensaio composta por 148 microliters de PBS e 20 microliters de GSH a 25 nanomolar para uma reação. Misture bem a solução. Para os poços de teste, adicione dois microliters do inibidor GST, 20 microliters de GST, 0,1 unidade por mil e 168 microliters da solução de ensaio.
Para os poços de controle, adicione dois microliters do diluente utilizados para o inibidor GST, 20 microliters de GST 0,1 unidade por mil e 168 microliters da solução de ensaio. Para os poços em branco, adicione dois microliters do diluente utilizados para o inibidor GST, 20 microliters de água e 168 microliters da solução de ensaio. Adicione 10 microliters da solução CDNB para cada poço, incluindo o em branco.
Misture o agitador por alguns segundos. Regisso absorvente em 340 nanômetros a cada minuto durante 10 minutos. Calcule o IC50 com um software especializado.
Prepare quatro soluções cdnb em diferentes concentrações, conforme explicado no protocolo. Prepare três soluções inibidoras GST em diferentes concentrações, também conforme explicado no protocolo. Prepare as soluções enzimáticas contendo 148 microliters de PBS e 20 microliters de GSH a 25 mililitros para uma reação.
Para os poços de controle, adicione dois microliters do diluente utilizados para o inibidor GST. E para o teste e poços em branco, dois microliters da solução inibidora GST correta. Misture por alguns segundos.
Adicione 168 microliters da solução enzimática a cada poço. Adicione 10 microliters das concentrações de CDNB correspondentes em cada poço respectivo. Misture por alguns segundos e, em seguida, grave a absorvância em 340 nanômetros a cada minuto durante 10 minutos.
Repita o experimento usando o mesmo padrão de revestimento para usar as quatro concentrações diferentes de CDNB ao longo das três concentrações diferentes do inibidor GST. Analise os resultados com um software especializado para determinar o modo de inibição, bem como o Ki.Este protocolo foi aplicado à curcumina, uma molécula com propriedades anticancerígenas. Este composto foi selecionado por previsões computacionais da afinidade vinculante para várias isoformas GST.
Paralelamente, os mesmos experimentos foram realizados com ácido ethacúnico, o inibidor GST mais utilizado no ambiente laboratorial como controle positivo. A potência inibitória foi testada em um pool de GSTs do fígado equino e pode ser aplicada a qualquer isoforms GST de escolha. O IC 50, bem como o tipo de inibição e o Ki foram determinados.
Para fornecer as melhores condições de ensaio, primeiro, michaelis-menten constante, Km do substrato CDNB com um pool de GSTs foi determinado. Km representa a afinidade entre o substrato e a enzima. A determinação desse valor é crucial para utilizar uma concentração não saturada para a redação.
De fato, duas altas concentrações podem desvantagem dos inibidores competitivos, enquanto que muito pouca quantidade não será detectável. Por favor, veja textos para obter mais detalhes sobre isso. Para este experimento, foram utilizadas seis concentrações diferentes de CDNB com concentração fixa de enzimas GSH e GST.
O gráfico de Michaelis-Menten foi obtido plotando as concentrações de substrato em mililitros no eixo X e a velocidade em mililitro por minuto no eixo Y. A velocidade da reação foi calculada com a equação um. O km é determinado como metade Vmax, valor obtido após a saturação da solução com o substrato, a fim de obter um platô de formação conjugada.
O Km do CDNB para a solução enzimática GST testada foi determinado como 0,26 mililitro com base em cálculos com software especializado. IC50 é definido como a concentração de substância necessária para inibir a atividade enzimática pela metade. O IC50 foi estimado por meio de um gráfico de regressão não linear onde a concentração logarítmica do inibidor GST foi plotada no eixo X e a porcentagem da atividade GST no eixo Y.
Foram utilizadas nove concentrações diferentes de inibidor. A atividade GST foi determinada com a aplicação da equação um. Os resultados foram normalizados utilizando-se o controle sem inibidor.
A curcumina é mal solúvel em água. Assim, não foram possíveis maiores concentrações, dificultando a obtenção da inibição máxima. No entanto, um software especializado foi capaz de prever o IC50 do currículo para este pool de GST a um valor de 31,4 micromolar.
Paralelamente, o mesmo experimento foi conduzido com ácido ethacúnico como um controle positivo. Como esperado, esta molécula foi confirmada como um inibidor GST com um IC50 de 6,7 micromolar. Estes resultados confirmaram que a curcumina é também um inibidor GST com ic50 na faixa de micromolar, semelhante ao ácido ethacúnico.
Para estudar mais detalhadamente a curcumina como inibidor gst, o tipo de inibição, bem como a constante de inibição, Ki, foram determinados. Primeiro, o tipo de inibição foi avaliado com os gráficos Michaelis-Menten. Utilizando diferentes concentrações do cdnb substrato enquanto incrementa as concentrações do inibidor GST, Kms aumentou significativamente em correlação com as concentrações de curcumina, enquanto o Vmax permaneceu inalterado apesar das condições variadas.
Este modo de inibição é típico de um modo competitivo de inibição. Para obter mais detalhes sobre os outros tipos de inibições, consulte o texto. Ki foi calculado nesse momento com base no tipo de inibição usando o mesmo conjunto de dados, fornecendo um valor de 23,3 micromolar de curcumina.
Os métodos explicados são ensaios enzimáticos básicos, que requerem cuidado através de certas etapas, a fim de fornecer resultados corretos e reprodutíveis. A determinação do Km constante de Michaelis-Menten, que delineia a afinidade do substrato com a enzima é um dos passos cruciais. Na verdade, quando a concentração de substrato é muito alta ou muito baixa, torna difícil identificar o modo correto de inibição e Ki não é corretamente calculado.
Este procedimento pode ser aplicado aos GSTs recombinantes humanos, como exemplo GSTA1 e um de P1, são usados em estudos de cultura celular para avaliar o potencial a ser usado em combinação com agentes eletrofílicos para reduzir a resistência a medicamentos.
