グルタチオンSトランスレポラーーゼは、細胞内の電子メール性化合物を分解し、アポトーシス経路に関与するMAPキナーゼと相互作用する代謝酵素である。GSTの発現のこれら2つの役割は薬剤耐性と相関しているため、この問題に対抗する解決策は酵素阻害剤を使用することである。このプロトコルを使用して、我々はそのような分子をテストする方法を提供します。
この方法は、酵素と化合物の相互作用を調べる迅速かつ容易な方法を利用したいGST阻害剤の分野に新しいすべての人に向け出しています。また、阻害濃度50、IC50、および阻害の一定の2つの特徴を決定するためのステップを提供Ki.As、我々は阻害の様式を定義する技術を十分に説明した、異なる生物学的影響を有する重要な特徴である。最初のステップは、単位あたりの溶液中のGSTの酵素活性を決定することです。
1ミルあたり1単位は、1分間に1マイクロモルの製品を合成するのに必要な酵素の体積です。酵素溶液のタンパク質濃度を定量化します。あなたの都合に応じて技術を選択してください。
タンパク質溶液を水中の1ミル当たり0.02ミリグラムの最終濃度に希釈します。酵素ソリューションを氷の上に置いてください。96ウェルプレートで反応を準備します。
空の井戸に20マイクロリットルの水を加えます。テストウェル用の酵素溶液を20マイクロリットル追加します。GSHを20マイクロリットル加えます。
PBSを150マイクロリットル加えます。各井戸に50ミリモルでCDNBの10マイクロリットルを追加します。シェーカーのプレートを数秒間混ぜます。
分光光度プレートリーダーでは、1分340ナノメートルの吸光度を10分間記録します。スプレッドシートと特殊なソフトウェアで結果を分析します。得られた結果によると、水のミルあたり0.1単位でGSTストック溶液を調製する。
6種類のCDNB濃度を95%エタノールで20回、最終容量200マイクロリットルで調製します。すべての井戸に、25ミリモルでGSHの20マイクロリットルを追加します。試験井戸に、1ミルあたり0.1単位でGSTの20マイクロリットルを加えます。
空の井戸に20マイクロリットルの水を加えます。すべての井戸に、PBSの150マイクロリットルを追加します。試験井戸とブランクウェルに、対応するCDNB溶液の10マイクロリットルを加えます。
CDNB のすべての濃度は、特定のブランクを必要とします。シェーカーの内容を数秒間混ぜ、1分340ナノメートルで吸光度を10分間記録します。特殊なソフトウェアを使用して結果を分析します。
ミカハイ・メンテンのプロットを描いてKmを決定します。結果によれば、得られたKmの20倍の95%エタノールでCDNB溶液を調製した。必要な濃度にインヒビター溶液を希釈します。
96ウェルプレートに、潜在的なGST阻害剤の2マイクロリットルを追加します。ブランクウェルに、希釈剤の2マイクロリットルを加えます。すべての井戸とPBSの168マイクロリットルに25ミリモルでGSHの20マイクロリットルを追加します。
前のステップで見つかった20回のKMのCDNBの10マイクロリットルを追加します。シェーカーのプレートを数秒間混ぜます。1分340ナノメートルで吸光度を10分間記録します。
特殊なソフトウェアを使用して結果を分析します。結果によると、同じブランクを各GST阻害剤に使用するか、調整する必要があります。試験されたGST阻害剤の9濃度を調製する。
1つの反応のために25ナノモルでPBSの148マイクロリットルとGSHの20マイクロリットルからなるエッセイ溶液を準備する。溶液をよく混ぜる。試験井戸には、GST阻害剤2マイクロリットル、GST20マイクロリットル、1ミルあたり0.1単位、および168マイクロリットルのアッセイ溶液を加えます。
コントロールウェルには、GST阻害剤に使用される希釈剤の2マイクロリットル、1ミルあたり20マイクロリットルのGST 0.1単位、およびアッセイ溶液の168マイクロリットルを加えます。ブランクウェルの場合、GST阻害剤に使用される希釈剤の2マイクロリットル、20マイクロリットルの水、168マイクロリットルのアッセイ溶液を加えます。ブランクを含む各ウェルに対して10マイクロリットルのCDNB溶液を加えます。
シェイカーの上で数秒間混ぜます。1分340ナノメートルで吸光度を10分間記録します。特殊なソフトウェアで IC50 を計算します。
プロトコルで説明されているように、異なる濃度で4つのCDNBソリューションを準備します。プロトコルで説明されているように、異なる濃度で3つのGST阻害剤溶液を調製する。1つの反応のために25ミリモルでPBSの148マイクロリットルとGSHの20マイクロリットルを含む酵素溶液を準備する。
コントロールウェルの場合は、GST阻害剤に使用される希釈剤を2マイクロリットル加えます。そして、試験およびブランクウェルのために、正しいGST阻害剤溶液の2マイクロリットル。数秒間混ぜます。
各ウェルに酵素溶液の168マイクロリットルを追加します。対応するCDNB濃度の10マイクロリットルを各ウェルに加えます。数秒間混ぜ合わせ、1分当り340ナノメートルで吸光度を10分間記録します。
GST阻害剤の3つの異なる濃度に沿ってCDNBの4つの異なる濃度を使用するために同じめっきパターンを使用して実験を繰り返します。特殊なソフトウェアで結果を分析し、阻害モードを決定し、Ki.Thisプロトコルは抗癌特性を有する分子であるクルクミンに適用されました。この化合物は、いくつかのGSTアイソフォームに対する結合親和性の計算予測により選択した。
並行して、同じ実験をエタクリン酸に対して行い、実験室環境で最も広く使用されているGST阻害剤を陽性対照として行った。阻害力は、馬の肝臓からGSTのプールでテストされ、選択した任意のGSTアイソフォームに適用することができます。IC50と阻害の種類とKiを決定した。
最良のアッセイ条件を提供するために、まず、ミカリス・メンテン定数、GSTsのプールを有する基質CDNBのKmが決定された。Kmは、基質と酵素との親和性を表すものである。エッセイに非飽和濃度を使用するには、この値の決定が重要です。
実際、2つの高濃度は競合性阻害剤に不利である可能性がありますが、少量では検出できません。詳細については、テキストを参照してください。この実験では、GSHおよびGST酵素の固定濃度でCDNBの6つの異なる濃度を使用した。
ミカエル-メンテングラフは、X軸上のミリモルで基板濃度を、Y軸上で毎分ミリモル単位の速度をプロットすることによって得られた。反応の速度は式1で算出した。Kmは、Vmaxの半分として決定され、共役形成のプラトーを得るために基板を用いて溶液を飽和させた後に得られる値である。
テストされたGST酵素溶液のためのCDNBのKmは、特殊なソフトウェアでの計算に基づいて0.26ミリモルとして決定された。IC50は、酵素活性を半分に阻害するのに必要な物質の濃度と定義される。IC50は、GST阻害剤の対数濃度をX軸にプロットした非線形回帰グラフを用いて、Y軸上のGST活性の割合を測定することによって推定した。
9種類の異なる濃度の阻害剤が使用された。GST活動は、式1の適用で決定された。結果は、阻害剤を有さない対照を用いて正規化した。
クルクミンは水に難溶性です。このように高濃度では使用が不可能で、最大の阻害を得ることが困難であった。それにもかかわらず、特殊なソフトウェアは、このGSTプールのカリキュラムのIC50を31.4マイクロモルの値で予測することができました。
同様に、同じ実験を、正の対照としてエタクリン酸を用いて行った。予想通り、この分子は6.7マイクロモルのIC50を有するGST阻害剤として確認された。これらの結果は、クルクミンがエタクリン酸と同様に、マイクロモル範囲のIC50を有するGST阻害剤であることを確認した。
GST阻害剤としてより詳細にクルクミンを研究するために、阻害の種類、ならびに阻害の定数、Ki、を決定した。まず、ミカエル・メンテングラフで阻害の種類を評価した。GST阻害剤の濃度を増加させながら、基質CDNBの異なる濃度を使用することにより、Kmsはクルクミン濃度との相関において有意に増加し、Vmaxは様々な条件にもかかわらず変わらなかった。
この阻害モードは、競争的な阻害モードの典型である。その他の種類の阻害の詳細については、テキストを参照してください。Kiは、同じデータセットを使用して阻害の種類に基づいてそれに基づいて計算され、クルクミンの23.3マイクロモルの値を提供した。
説明された方法は、正しく、再現可能な結果を提供するために、特定のステップを通じて慎重に必要な基本的な酵素エッセイです。ミカエル・メンテン定数Kmの決定は、酵素に対する基質の親和性を示す重要なステップの1つである。実際、基質濃度が高すぎたり低すぎたりすると、正しい阻害様式を特定することが困難になり、Kiが正しく計算されない。
この手順は、ヒト組換えGSTに適用することができ、GSTA1およびP1の一つとして、薬剤耐性を低下させるために電気性薬剤と組み合わせて使用する可能性を評価する細胞培養研究で使用される。
